Name: قياس طول ذيل بولي أ من دماغ يرقة ذبابة الفاكهة وخط الخلية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: تعلم قياس طول ذيل بولي أ في الجهاز العصبي لذبابة الفاكهة باستخدام طريقة GI-tailing PCR. تكشف هذه التقنية آليات تنظيم جين Dscam الفريدة في تطور الأعصاب.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية R01NS116463 إلى JK ، ومرفق التصوير الخلوي والجزيئي الأساسي في جامعة نيفادا ، رينو ، والذي تم دعمه من قبل المعاهد الوطنية للصحة Grant P20GM103650 واستخدامها للبحث المذكور في هذه الدراسة.

تحديد طول بولي (أ) للجينات من الجهاز العصبي ذبابة الفاكهة

<ol><li>Stewart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyadenylation+and+nuclear+export+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Polyadenylation and nuclear export of mRNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).</li>
<li>Machida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interaction+of+poly%28A%29-binding+protein+with+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17435(2018).</li>
<li>Eisen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+cytoplasmic+mRNA+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism.</a> Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).</li>
<li>Liudkovska, V., Dziembowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanisms+of+RNA+tailing+by+metazoan+terminal+nucleotidyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+RNA%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622(2021).</li>
<li>Goldstrohm, A. C., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+deadenylase+complexes+diversify+mRNA+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).</li>
<li>Schmidt, M. J., Norbury, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyadenylation+and+beyond%3A+emerging+roles+for+noncanonical+poly%28A%29+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+interdisciplinary+reviews+RNA%22%5BJournal%5D)">Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases.</a> Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).</li>
<li>Laishram, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28A%29+polymerase+%28PAP%29+diversity+in+gene+expression+-+Star-PAP+vs+canonical+PAP%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression - Star-PAP vs canonical PAP.</a> FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).</li>
<li>Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+initiation+of+Drosophila+development+by+regulated+polyadenylation+of+maternal+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs.</a> Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).</li>
<li>Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanos+and+pumilio+establish+embryonic+polarity+in+Drosophila+by+promoting+posterior+deadenylation+of+hunchback+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA.</a> Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).</li>
<li>Passmore, L. A., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mRNA+poly%28A%29+tails+in+regulation+of+eukaryotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).</li>
<li>Murray, E. L., Schoenberg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+determining+poly%28a%29+tail+length+and+the+polarity+of+mRNA+decay+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).</li>
<li>Salles, F. J., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+poly%28a%29+tail+lengths+by+PCR%3A+The+PAT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).</li>
<li>Salles, F. J., Darrow, A. L., O'Connell, M. L., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+novel+murine+maternal+mRNAs+regulated+by+cytoplasmic+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation.</a> Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).</li>
<li>Salles, F. J., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+analysis+of+mRNA+polyadenylation+states+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR.</a> Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).</li>
<li>Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ePAT%3A+A+simple+method+to+tag+adenylated+RNA+to+measure+poly%28a%29-tail+length+and+other+3%27+RACE+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3' RACE applications.</a> RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).</li>
<li>Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+accuracy+of+a+single-stranded+DNA+splint-mediated+ligation+assay+%28sPAT%29+reveals+poly%28a%29+tail+length+dynamics+of+developmentally+regulated+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs.</a> RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).</li>
<li>Martin, G., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailing+and+3%27-end+labeling+of+RNA+with+yeast+poly%28A%29+polymerase+and+various+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides.</a> RNA. 4 (2), 226-230 (1998).</li>
<li>Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+G-tailing+method+for+the+determination+of+the+poly%28a%29+tail+length+applied+to+hepatitis+a+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA.</a> Nucleic Acids Research. 29 (12), 57(2001).</li>
<li>Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+shows+that+miR-430+reduces+translation+before+causing+mRNA+decay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish.</a> Science. 336 (6078), 233-237 (2012).</li>
<li>Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28a%29-tail+profiling+reveals+an+embryonic+switch+in+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control.</a> Nature. 508 (1), 66-71 (2014).</li>
<li>Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAIL-seq%3A+Genome-wide+determination+of+poly%28a%29+tail+length+and+3%27+end+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3' end modifications.</a> Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).</li>
<li>Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLAM-seq%3A+Full-length+mRNA+sequencing+reveals+principles+of+poly%28A%29+tail+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control.</a> Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).</li>
<li>Garalde, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+direct+RNA+sequencing+on+an+array+of+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.</a> Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).</li>
<li>Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+leucine+zipper+kinase+regulates+Dscam+expression+through+a+noncanonical+function+of+the+cytoplasmic+poly%28A%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein.</a> Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).</li>
<li>Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insects%27+RNA+profiling+reveals+absence+of+%26%2334%3Bhidden+break%26%2334%3B+in+28S+ribosomal+RNA+molecule+of+onion+thrips%2C+Thrips+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Insects' RNA profiling reveals absence of &#34;hidden break&#34; in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci.</a> Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294(2015).</li>
<li>Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+in+the+nervous+system%3A+to+what+lengths+will+3%27+UTR+extensions+take+us%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3' UTR extensions take us.</a> Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).</li>
<li>Sement, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Uridylation+prevents+3%27+trimming+of+oligoadenylated+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">et al Uridylation prevents 3' trimming of oligoadenylated mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

في هذا البروتوكول ، نصف تقنية تشريح دماغ يرقات ذبابة الفاكهة من تجول3 المرحلة الداخلية بالإضافة إلى تحضير العينة من خلايا ذبابة الفاكهة S2. نظرا للطبيعة المرنة ل mRNAs ، يتطلب جمع العينات مزيدا من الحذر. بالنسبة لتشريح دماغ اليرقات ، يجب عدم تلف الأدمغة أثناء العزلة ويجب عدم الاحتفاظ بها في محلول لفترة طويلة. من الضروري الحفاظ على وقت التشريح إلى 8-10 دقائق لجولة من التشريح. قد يكون من المفيد أيضا استكمال محلول التشريح بمثبطات RNAase. أما بالنسبة لزراعة الخلايا S2 ونقلها ، فقم بتنفيذ جميع الخطوات في غطاء التدفق الصفحي.
تتطلب خطوة عزل الحمض النووي الريبي دراسة إضافية. نوصي باستخدام مساحة نظيفة من نوع التدفق الصفحي تتم معالجتها مسبقا بمحاليل إزالة RNase. بصرف النظر عن إنتاجية الحمض النووي الريبي ، من الضروري التحقق من سلامة الحمض النووي الريبي للتأكد من أن العينة لم تتحلل أثناء خطوات التشريح والعزل. يمكن تصور سلامة الحمض النووي الريبي عن طريق تغيير طبيعة هلام الأغاروز الكهربائي. يظهر إجمالي الحمض النووي الريبي من ذبابة الفاكهة ملف تعريف نطاق واحد لأن 28S rRNA يتم فصله إلى وحدتين فرعيتين متساويتين في الحجم ، والتي تتوافق مع 18S rRNA25. يمكن اعتبار هذا نطاقا واحدا من حوالي 600 نيوكليوتيدات عند استخدام سلم RNA أحادي الشريط (الشكل 2 أ).
تخضع عينات الحمض النووي الريبي المعزولة لمخلفات G / I (الشكل 2 ب). تضاف بقايا Guanosine و inosine في الطرف 3 من الحمض النووي الريبي بواسطة بوليميراز الخميرة بولي (A) (PAP) 17 ، الذي يحافظ على الطرف 3 من الحمض النووي الريبي من التدهور الأنزيمي. يتم نسخ الحمض النووي الريبي كامل الطول المحمي بعلامة G / I المركب حديثا بشكل عكسي للحصول على عينات cDNA باستخدام التمهيدي العكسي العالمي (C10T2 الموسوم ب 3 بوصات). متبوعا بتفاعل البوليميراز المتسلسل مع البادئات الأمامية / الخلفية الخاصة بالجينات في أعلى موقع polyadenylation لتوليد منتج PCR يظهر شريطا حادا. تولد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل من البادئات الأمامية والعكسية العالمية أطوال غير محددة من جزيئات الحمض النووي كمسحة على الجل ، والتي تعكس أطوال متفاوتة من ذيول poly (A). تم تحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لاحقا عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الشعري.
عند تصميم الاشعال ، من المهم ملاحظة أن حجم amplicon مع الاشعال الأمامية / العكسية الخاصة بالجينات يجب أن يكون في حدود 50-300 bp. يعطي اختبار العديد من البرايمرات الأمامية فرصة للعثور على أفضل برايمر يعمل مع تقييم ذيل poly (A). نوصي بتصميم برايمر عكسي للمنتجات الخاصة بالجينات في أعلى موقع بدء poly (A) المتوقع لأن هذا يوفر فرصة لحساب مباشر لأطوال ذيل poly (A). عند تشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من المهم إجراء "عدم التحكم في النسخ العكسي" لاستبعاد التضخيم من الحمض النووي الجينومي الملوث. يوصى بشدة بتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل مع تدرج درجة حرارة التلدين. نظرا لطبيعة هذه المنهجية ، فإن تحليل أطوال ذيل poly (A) لأنواع mRNA متعددة الأدينيل البديلة يتطلب دراسة إضافية. على سبيل المثال ، تخضع العديد من الجينات لبولي أدينيل بديل لتوليد أنواع مختلفة من 3'UTR26. نوصي باستخدام مجموعات أولية مختلفة من تفاعل البوليميراز المتسلسل لدراسة أنواع 3'UTR الفردية.
نوصي بشدة بتضمين منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالجينات على الرحلان الكهربائي للهلام الشعري في كل تشغيل نظرا لوجود فرق هجرة محتمل لعدد قليل من النيوكليوتيدات في كل شوط. من الضروري استخدام حجم الزوج الأساسي الفعلي لتفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالجين بدلا من الأحجام النظرية عند حساب طول ذيل poly (A).
تخضع بعض الحمض النووي الريبي لتعديلات إضافية بعد النسخ ، بما في ذلك uridylationالطرفي 27. قد لا تكون طريقة المخلفات G / I مناسبة لقياس طول ذيل poly (A) عندما يتم يوريديلات mRNA. وذلك لأن التمهيدي العكسي العالمي قد لا يضخم بكفاءة أنواع mRNA التي تحتوي على نيوكليوتيدات غير أدينين في نهايتها 3'. إن مخلفات G / I هي طريقة قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والتي من المحتمل أن تخلق تحيزا غير مرغوب فيه عن طريق تضخيم الأجزاء الأقصر بشكل أكثر كفاءة. وبالتالي ، يجب على المستخدمين توخي الحذر عند تفسير النتيجة.
باستخدام الطريقة الموضحة هنا، أثبتنا أنه يمكن استخدام المخلفات G/I بكفاءة لقياس طول ذيل بولي (A) من الجهاز العصبي لذبابة الفاكهة وخلايا S2. هذه الطريقة كمية للغاية عندما تقترن بالرحلان الكهربائي الشعري. في حين أن التحليلات عالية الإنتاجية توفر تحليلا عالميا لذيل poly (A) ، فإن طريقة PCR منخفضة الإنتاجية القائمة على المخلفات G / I لا تزال مفيدة جدا لتحليل النص الفردي والتجارب التجريبية والتحقق من صحة الطرق الأخرى. باختصار ، يعتمد اختيار الطريقة على أسئلة وأهداف البحث المحددة. يجب على الباحثين اختيار الطريقة التي تناسب احتياجاتهم ومواردهم التجريبية.

معظم mRNAs حقيقية النواة هي polyadenylated بعد النسخ في نهايتها 3 ′ في النواة عن طريق إضافة الأدينوزينات غير المقولبة بواسطة بوليميراز بولي (A) الكنسي. يعد ذيل poly (A) السليم محوريا طوال دورة حياة mRNA ، لأنه ضروري لتصدير mRNAالنووي 1 ، ويسهل التفاعل مع البروتينات المرتبطة ب poly (A) لتعزيز الكفاءة الانتقالية2 ، ويضفي مقاومة ضد التدهور3. في بعض الحالات، يمكن أن يخضع ذيل بولي (أ) أيضا للتمدد في السيتوبلازم، الذي تسهله بوليميراز بولي (أ) غير المتعارف عليه4. في السيتوبلازم ، يتغير طول ذيل بولي (A) ديناميكيا ويؤثر على العمر الافتراضي لجزيء mRNA. تشتهر العديد من البلمرة و deadenylases بتعديل طول الذيل5،6،7. على سبيل المثال ، يرتبط تقصير ذيول poly (A) بالقمع الانتقالي ، في حين أن إطالة ذيول poly (A) تعزز الترجمة 8,9.
أظهرت الدراسات الجينومية المتراكمة الأهمية الأساسية لطول ذيل poly (A) عبر جوانب مختلفة من بيولوجيا حقيقية النواة. وهذا يشمل الأدوار في تطوير الخلايا الجرثومية ، والتطور الجنيني المبكر ، واللدونة العصبية المشبكية للتعلم والذاكرة ، والاستجابة الالتهابية10. تم تطوير العديد من الطرق والمقايسات لقياس أطوال ذيل poly (A). على سبيل المثال ، يستفيد اختبار RNase H / oligo (dT) من RNase H في وجود أو عدم وجود oligo (dT) لدراسة طول ذيل poly (A)11,12. تشمل الطرق الأخرى لدراسة ذيل poly (A) تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لنهايات 3 بوصات مثل التضخيم السريع لنهايات cDNA اختبار poly (A) (RACE-PAT) 12،13 واختبار poly (A) بوساطة ligase (LM-PAT) 14. تشمل التعديلات الإضافية لمقايسة PAT ePAT15 و sPAT16. الأنزيمية G-tailing17,18 أو G / I-tailing من نهاية 3 'هي اختلافات أخرى في فحص PAT. يتضمن التعديل الإضافي لهذه التقنيات استخدام البادئات ذات العلامات الفلورية جنبا إلى جنب مع الرحلان الكهربائي للهلام الشعري للتحليل عالي الدقة ، والذي يشار إليه باسم اختبار poly (A) عالي الدقة (Hire-PAT) 19. تسمح هذه المقايسات التي تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل بتحديد كمية طول بولي (أ) بسرعة وعالية الحساسية.
مع تطوير تسلسل الجيل التالي ، تسمح طريقة التسلسل عالية الإنتاجية ، مثل PAL-seq20 و TAIL-seq21 ، بتحليلات polyadenylation على نطاق واسع للنسخ. ومع ذلك ، توفر هذه الطرق قراءات تسلسل قصيرة فقط من 36-51 نيوكليوتيدات. لذلك ، تم تطوير FLAM-Seq22 لتحديد طول الذيل العالمي ل mRNA كامل الطول ويوفر قراءات طويلة. توفر تقنية Nanopore23 تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر المستقل عن تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تسلسل cDNA المباشر لتقديرات طول الذيل poly (A). ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب عالية الإنتاجية لا تخلو من القيود. إنها تتطلب كميات كبيرة من المواد الأولية ، وهي باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون تحليل النصوص النادرة أمرا صعبا للغاية مع الطرق عالية الإنتاجية ، ولا تزال الطرق منخفضة الإنتاجية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل توفر ميزة عندما يحتاج عدد صغير من النصوص إلى التحليل ، لإجراء تجارب تجريبية ، والتحقق من صحة الطرق الأخرى.
لقد أثبتنا مؤخرا أن Dscam1 mRNAs تحتوي على ذيول بولي (A) قصيرة في ذبابة الفاكهة ، مما يستلزم ارتباطا غير قانوني للبروتين المرتبط بالسيتوبلازم poly (A) على Dscam1 3'UTR باستخدام طريقة المخلفات G / I24. نقدم هنا إجراء مبسطا لإعداد الأنسجة وتحديد طول poly (A) من mRNAs من الجهاز العصبي لذبابة الفاكهة وخلايا ذبابة الفاكهة S2.

<table><tbody><tr><td>3- (N-morpholino) حمض البروبان سلفونيك (MOPS) منتج</td> <td>البحث الدولي (RPI)</td> <td>M92020</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية</td><td>Agilent Technologies</td> <td>&nbsp ؛ 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>برنامج Agilent 2100 خبير تحميل مجاني تجريبي</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259</td></tr><tr><td>Apex 100 bp-Low DNA سلم</td><td>Genesee Scientific</td><td>19-109</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC)البحث</td> <td>المنتج الدولي (RPI)&nbsp;</td><td>صبغة الحمض النووي D43060</td><td></td></tr><tr><td>(صبغة تحميل الجل ، أرجواني (6x)</td> <td>مختبرات نيو إنجلاند الحيوية &nbsp ؛</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>ذبابة الفاكهة S2 خط الخلية</td><td>ذبابة الفاكهة مركز موارد الجينوم مخزون # 181</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ذبابة الفاكهة شنايدر s متوسطة</td><td>الحرارية فيشر علمية</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>Ehidium بروميد</td><td>Genesee علمي&nbsp;</td><td>20-276</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>ملقط Dumont 5&nbsp; &nbsp;</td><td>أدوات العلوم الجميلة&nbsp;</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>مياه خالية من النويذ</td><td>ثيرمو فيشر علمي&nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>منتجات البحث الدولية (RPI)&nbsp;</td><td>P32200</td><td></td></tr><tr><td>بولي (A) طقم فحص طول الذيل</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp ؛</td><td>764551KT</td><td></td></tr><tr><td>RiboRuler سلم الحمض النووي الريبي منخفض</td><td>المدى ثيرمو فيشر العلمي&nbsp;</td><td>SM1833</td><td></td></tr><tr><td>صبغة تحميل هلام الحمض النووي الريبي (2x) ثيرمو</td> <td>فيشر العلمي &nbsp ؛</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>RNA microprep kit</td><td>Zymoresearch&nbsp;</td><td>R1050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>طقم التحضير المصغر للحمض النووي الريبي</td><td>Zymoresearch&nbsp;</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>مقص - مقص زنبركي Vannas - 2.5 مم</td><td>أدوات العلوم الدقيقة المتطورة &nbsp;</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>أقراص TopVision Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R2802</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetate-EDTA (TAE)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr></tbody></table>

قياس طول ذيل بولي أ من دماغ يرقة ذبابة الفاكهة وخط الخلية

Measurement of Poly A Tail Length from Drosophila Larva Brain and Cell Line

Polyadenylation هو تعديل حاسم بعد النسخ يضيف ذيول poly (A) إلى الطرف 3 'من جزيئات mRNA. يتم تنظيم طول ذيل poly (A) بإحكام بواسطة العمليات الخلوية. ارتبط عدم تنظيم polyadenylation mRNA بالتعبير الجيني غير الطبيعي وأمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية وتشوهات النمو. لذلك ، فإن فهم ديناميكيات polyadenylation أمر حيوي لكشف تعقيدات معالجة mRNA وتنظيم الجينات بعد النسخ. 
يقدم هذا البحث طريقة لقياس أطوال ذيل poly (A) في عينات الحمض النووي الريبي المعزولة من أدمغة يرقات ذبابة الفاكهة وخلايا ذبابة الفاكهة شنايدر S2. استخدمنا نهج مخلفات جوانوزين / إينوزين (G / I) ، والذي يتضمن الإضافة الأنزيمية لبقايا G / I في نهاية 3 'من mRNA باستخدام بوليميراز الخميرة بولي (A). يحمي هذا التعديل نهاية الحمض النووي الريبي 3 'من التدهور الأنزيمي. ثم يتم نسخ ذيول poly (A) المحمية كاملة الطول بشكل عكسي باستخدام طبقة أولية عالمية مضادة للحساسية. بعد ذلك ، يتم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام oligo خاص بالجين يستهدف الجين محل الاهتمام ، جنبا إلى جنب مع oligo تسلسل عالمي يستخدم للنسخ العكسي. 
هذا يولد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تشمل ذيول بولي (أ) للجين محل الاهتمام. نظرا لأن polyadenylation ليس تعديلا موحدا وينتج عنه ذيول بأطوال متفاوتة ، فإن منتجات PCR تعرض مجموعة من الأحجام ، مما يؤدي إلى نمط تشويه على هلام الأغاروز. أخيرا ، تخضع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للرحلان الكهربائي للهلام الشعري عالي الدقة ، يليه القياس الكمي باستخدام أحجام منتجات poly (A) PCR ومنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالجينات. توفر هذه التقنية أداة مباشرة وموثوقة لتحليل أطوال ذيل poly (A) ، مما يمكننا من اكتساب رؤى أعمق حول الآليات المعقدة التي تحكم تنظيم mRNA.

هنا ، قمنا بتحليل طول ذيل poly (A) ل Dscam1 و GAPDH من أدمغة يرقات ذبابة الفاكهة (الشكل 4). تم تصور الحمض النووي الريبي المعزول على هلام الأغاروز لمراقبة الجودة. يشير نطاق الحمض النووي الريبي الواحد بحجم 600 نيوكليوتيد تقريبا إلى تحضير الحمض النووي الريبي السليم (الشكل 2 أ). تم إخضاع الحمض النووي الريبي لمخلفات G / I والرحلان الكهربائي الشعري عالي الدقة باستخدام محلل حيوي Agilent 2100. تم تصدير صور الجل باستخدام برنامج Agilent 2100 Expert وتم تجميعها وفقا لذلك. أظهرت منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من أزواج التمهيدي الخاصة بالجينات GAPDH و Dscam1 نطاقا واحدا متميزا بينما أظهرت منتجات أزواج التمهيدي الخاصة بالجينات / العالمية أنماط لطاخة مميزة (الشكل 4A والجدول 1) ، مما يشير إلى الطول التفاضلي poly (A) ل GAPDH و Dscam1 mRNAs. في الشكل 4B ، تم استخدام تحليل اللطاخة للحصول على متوسط أطوال ذيل poly (A) من GAPDH و Dscam1. تم تصدير المخططات الكهربائية وتعديلها لتمثيل أطوال ذيل poly (A) (الشكل 4C).
وبالمثل ، أجرينا تحليل طول الذيل poly (A) على خلايا S2 (الشكل 5). لتحديد دور Dscam1 3'UTR في تقصير ذيول poly (A) ، تم نقل خلايا S2 مع بلازميدات الحمض النووي التي تحتوي على منطقة ترميز Dscam1 إما مع SV40 3'UTR أو Dscam1 3'UTR. تم اختيار الحد الأدنى SV40 3'UTR للتحكم في Dscam1 3'UTR حيث تم استخدام SV40 3'UTR على نطاق واسع كإشارة إنهاء النسخ الدنيا و polyadenylation لبلازميدات الحمض النووي المؤتلف. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي وتعريضه ل RT-PCR ، ومخلفات G / I ، والرحلان الكهربائي الشعري عالي الدقة (الشكل 5). أظهرت النتائج أن توزيع طول الذيل poly (A) من بلازميد SV40 3'UTR اتبع نمطا مشابها لنمط GAPDH الداخلي بينما اتبع توزيع طول الذيل poly (A) من بلازميد Dscam1 3'UTR نمطا مشابها لنمط Dscam1 mRNA الداخلي من أدمغة اليرقات.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66116/66116fig04.jpg"> الشكل 4: قياس طول ذيل Poly(A) ل GAPDH و Dscam1 من أدمغة اليرقات. (أ) يحل الرحلان الكهربائي للهلام الشعري منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالجين كشريط منفصل (الممرات الأولى والثانية) ل GAPDH2 و Dscam1. يظهر منتج PCR باستخدام التمهيدي العكسي العالمي توزيع اللطاخة (الممر الثالث والرابع). * فرقة غير محددة. (ب) تم حساب متوسط أطوال ذيل بولي (أ) باستخدام تحليل اللطاخة. (C) تم إعادة بناء توزيع طول ذيل poly (A) من ملف csv المصدر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66116/66116fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66116/66116fig05.jpg"> الشكل 5: قياس طول ذيل Poly(A) لبلازميد الحمض النووي Dscam1 المنقول. تم نقل خلايا ذبابة الفاكهة S2 المستزرعة مع تركيبات Dscam1 التي تحتوي على منطقة ترميز Dscam1 ، و 3′UTR إما Dscam1 أو SV40. (أ) يتم عرض صور الرحلان الكهربائي للهلام الشعري لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالجين كنطاق منفصل (الممرات الأولى والثانية) ل SV40 (Dscam1-SV40 3'UTR) و Dscam1 (Dscam1-Dscam1 3'UTR). يظهر منتج PCR باستخدام التمهيدي العكسي العالمي نمط اللطاخة (الممرات الثالثة والرابعة). * فرقة غير محددة. (ب) تم حساب متوسط أطوال ذيل بولي (أ) باستخدام تحليل اللطاخة. (C) تم إعادة بناء توزيع طول الذيل poly (A) من ملف csv المصدر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66116/66116fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>دسكاما 1</td>
		</tr><tr><td>التمهيدي الأمامي (5'-3') CGCAGCCACAACAATTGAATG</td>
		</tr><tr><td>التمهيدي العكسي (5'-3') AAATAAAATCAAAATCATATATTTAGCAACTTATGAAC</td>
		</tr><tr><td>إس في 40</td>
		</tr><tr><td>التمهيدي الأمامي (5'-3') CCACAAAGGAAAAGCTGCAC</td>
		</tr><tr><td>التمهيدي العكسي (5'-3') TTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTTGCTTTTTTTTG</td>
		</tr><tr><td>جابد</td>
		</tr><tr><td>التمهيدي الأمامي (5'-3') CACTTCAGAAACGGCCTGAAAATGGC</td>
		</tr><tr><td>التمهيدي العكسي (5'-3') AATATTTAAATGCTTGAGTCGGCATTTTTAAAACTAC</td>
		</tr><tr><td>التمهيدي العكسي العالمي</td>
		</tr><tr><td>التمهيدي العكسي (5'-3') GGTAATACGACTCACTATAGCGAGACCCCCCCCTT</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: الاشعال المستخدمة في هذا البروتوكول. 
الملف التكميلي 1: تكوين الحلول وإعداد PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66116/66116_JOVE_Supp%20FIle%201.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

يصف البروتوكول طريقة فعالة وموثوقة لتحديد طول poly(A) للجين محل الاهتمام من الجهاز العصبي لذبابة الفاكهة ، والذي يمكن تكييفه بسهولة مع الأنسجة أو أنواع الخلايا من الأنواع الأخرى.

Polyadenylation is a crucial posttranscriptional modification that adds poly(A) tails to the 3' end of mRNA molecules. The length of the poly(A) tail is ...

Polyadenylation هو تعديل ما بعد النسخ. وهذا يضيف ذيول بولي-أ إلى الطرف ثلاثي الأعداد الأولية لجزيئات mRNA . ارتبط عدم تنظيم polyadenylation بالتعبير الجيني غير الطبيعي والأمراض المختلفة ، بما في ذلك الاضطرابات العصبية.توفر طريقتنا تحليلا عالي الدقة وفعالا من حيث التكلفة لقياس أطوال poly-A. توفر الطرق عالية الإنتاجية لتحليل ذيل poly-A ، مثل تسلسل الجيل التالي ، والتسلسل عالي الإنتاجية معلومات عالية المحتوى. ومع ذلك ، يمكن أن يكون تحليل النصوص النادرة أمرا صعبا للغاية باستخدام هذه الأساليب.عادة ما تكون الطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل منخفضة الإنتاجية. ومع ذلك ، يمكن استخدامها بسهولة لتحليل عدد صغير من النصوص. طريقة GI-tailing هي واحدة منهم.باستخدام هذه الطريقة ، اكتشفنا أن Dscam mRNAs تحتوي على ذيول بولي أ قصيرة. Dscam هو جزيء التصاق الخلايا العصبية. وتشارك في العديد من عمليات النمو العصبي الهامة.نظرا لأن Dscam mRNA يحتوي على ذيول poly-A قصيرة على عكس معظم mRNAs ، فإن ترجمة Dscam mRNA تخضع لتنظيم جيني فريد ، وهو أحد الأسئلة التي نحاول الإجابة عليها.

measurement-poly-tail-length-from-drosophila-larva-brain-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

نحن تصف Flippase بفعل القمع المتعدد الجوانب Gal80/Gal4 (FINGR) الأسلوب ، مما يسمح للأنسجة محددة FLP لتحديد أنماط التعبير Gal80. أينما Gal4 والتداخل FLP ، يتم تشغيل Gal4 التعبير على (Gal80 انقلبت الخروج) أو إيقاف (Gal80 المعكوسة في) الأسلوب FINGR هي متعددة للتحليل نسيلي ورسم خرائط الدوائر العصبية.

رسم الخرائط وتطبيق التعبير Flippase محسن شرك في اليرقات والكبار ذبابة الفاكهة CNS

نحن هنا وصف الإجراءات لاستخراج وتنقية ومرنا من...

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

هنا نقوم بتفصيل البروتوكولات المصممة خصيصا لمراقبة العيوب المورفولوجية التي تحدث خلال المراحل المبكرة والمتأخرة من الاستطالة الجنينية للديدان الخيطية Caenorhabditis elegans. في النهاية ، تم تصميم هذه البروتوكولات لتحديد الجينات التي تنظم هذه المراحل وتوصيف متطلباتها التفاضلية على طول المحور الأمامي الخلفي للجنين.

رواية مقاييس لوصف الجنينية الاستطالة للنيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

نبلغ عن إجراء موجز للتهجين الموضعي (FISH) في الغدد التناسلية والأجنة من Caenorhabditis elegans لمراقبة وقياس التسلسلات المتكررة. لقد نجحنا في ملاحظة وقياس تسلسلين متكررين مختلفين ، وتكرارات التيلومير ونموذج الإطالة البديلة للتيلوميرات (TALT).

المراقبة والكمي لالتيلومير وتسلسل المتكررة عن طريق الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) مع السلطة الوطنية الفلسطينية تحقيقات في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

لقد قمنا بتطوير سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف لاستخراج البيانات الكمية من دراسات بيولوجية الخلية المستندة إلى تصوير fluorescence تجميع البروتين والتمويه أوتوفاجيك في الجهاز العصبي المركزي لنماذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن.

بيولوجيا الخلية كمية من نيوروديجينيريشن في المورفولوجية من خلال تحليل غير منحازة للبروتينات فلوريسسينتلي المعلمة باستخدام إيماجيج

يتطلب تطور دماغ الثدييات التحكم السليم في التعبير الجيني على مستوى الترجمة. هنا، ونحن نصف نظام التنميط متعددة مع سهلة لتجميع السكروز التدرج صنع ومنصة الكسر لتقييم الحالة التحويلية من الحمض النووي الريبي في الدماغ النامية.

تحليل الترجمة في الدماغ الماوس النامية باستخدام التنميط متعددة

تحليل دورة الخلية مع 5-إيثيل-2'-deoxyuridine (EdU) وفوسفو-هيستون H3 (pH3) وضع العلامات هو إجراء متعدد الخطوات التي قد تتطلب التحسين واسعة النطاق. هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف جميع الخطوات لهذا الإجراء بما في ذلك تحليل الصورة وتحديد كميتها لتمييز الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة.

5-إيثينيل-2'-Deoxyuridine/فوسفو-هيستون H3 بروتوكول وضع العلامات المزدوجة لتحليل تطور دورة الخلية في الخلايا الجذعية العصبية Drosophila

يتم زيادة امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية Drosophila المتضررة من بروتين تار ملزمة الحمض النووي (TDP-43) اعتلال البروتين، كما هو مبين من قبل FRET القائم، ومستشعر الجلوكوز المشفرة وراثيا.

قياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43

يتم وصف بروتوكول يستخدم التشريح المجهري بالليزر لعزل أنسجة الديدان الخيطية الفردية لتسلسل الحمض النووي الريبي. لا يتطلب البروتوكول مجموعات أدوات وراثية خاصة بالأنواع ، مما يسمح بمقارنة ملامح التعبير الجيني بين الأنواع المختلفة على مستوى عينات الأنسجة المفردة.

التشريح المجهري بالليزر لتطبيقات الأنسجة الأحادية التي لا تعرف الأنواع

لفهم كيفية تحقيق الأشكال الخلية المعقدة ، مثل التشعبات العصبية ، خلال التنمية ، فمن المهم أن تكون قادرة على فحص دقيق أنيبيب المنظمة. نحن هنا وصف طريقة قوية لفحص العلامات immunohistological منظمة أنيبيب من التشعبات شجيري الخلايا العصبية الحسية تشجر والقصبة الهوائية ، والعضلات ،...

Immunohistological بطاقات المواد ميكروتثبول في الخلايا العصبية الحسية الانشعابيات ، القصبات الهوائية ، وعضلات في ذبابة الفاكهة الجدار اليرقة الهيئة

تعلم قياس طول ذيل بولي أ في الجهاز العصبي لذبابة الفاكهة باستخدام طريقة GI-tailing PCR. تكشف هذه التقنية آليات تنظيم جين Dscam الفريدة في تطور الأعصاب.

قياس طول ذيل بولي أ من دماغ يرقة ذبابة الفاكهة وخط الخلية

استكشف المزيد من الفيديوهات