الخلية العصبية من الثقافات Aplysia عن التصوير عالية الدقة من المخاريط النمو

في المختبر الافتراضي، نقوم باستزراع عصبونات الخلايا الخلفية من الرخويات البحرية من نوع Plegia california. تبرز هذه العصبونات مخاريط نمو كبيرة جداً، مما يجعلها نظاماً نموذجياً ممتازاً للدراسات عالية الدقة حول حركة مخاريط النمو وتوجيهها، وخاصة لتحليل ديناميكيات الهيكل الخلوي. ونوضح في هذا الفيديو كيفية إجراء عملية تشريح Plegia واستزراع الخلايا الخلفية.

مرحباً، أنا دانييل سوتر من قسم العلوم البيولوجية بجامعة بوردو. سنعرض لكم اليوم إجراءات تشريح وزراعة وتصوير العصبونات من الخلايا الدبقية في الحبل الشوكي. لقد استُخدمت العصبونات من الـ C, her apia CAA على نطاق واسع في دراسات التعلم والذاكرة.

بما أن ذبابة Apia تمتلك جهازاً عصبياً بسيطاً وعصبونات كبيرة مناسبة للدراسات الفيزيولوجية الكهربائية، فإننا نستخدم هذه العصبونات في مختبرنا لأن مخاريط نموها كبيرة ومناسبة جداً للتصوير عالي الدقة لديناميكيات البروتين المرتبطة بحركة مخروط النمو وتوجيهه. وتتضمن الإجراءات الكاملة الخطوات التالية.

في اليوم الأول، يتم التضحية بالحيوان وتشريحه للحصول على العقد البطنية. وفي اليوم الثاني، يتم تحضير أطباق الزرع، حيث تُشرح عناقيد الخلايا الظهرية وتُزرع العصبونات الفردية في الأطباق.

في اليوم الثالث، يتم إنشاء غرفة تصوير للتصوير الزمني للخلايا باستخدام مجهر التباين التداخلي التفاضلي DIC، مع الشرح والتوضيح. ستقوم iTune Lee، وهي طالبة دراسات عليا في مختبري، بإجراء العملية اليوم؛ حيث ستوضح لكم الآن كيفية تحضير العصبونات الخلفية.

فلنبدأ. تُعد عصبونات الخلايا الكيسية جزءاً من العقدة البطنية في الجهاز العصبي لـ plegia، لذا سنقوم بتشريح العقدة البطنية بأكملها لإجراء الهضم الإنزيمي. بعد ذلك، سنفصل مجموعتي الخلايا الكيسية عن بقية العقدة.

سيتم هضم العقدة البطنية في محلول المرحلة الثانية هذا لمدة تتراوح من 15 إلى 16 ساعة لتليين الأنسجة الضامة. نحتاج الآن إلى تحضير حقنة كبيرة سعة 60 milliliter مملوءة بـ 0.5 molar من كلوريد المغنيسيوم للتضحية بالحيوان، وتجهيز أدوات التشريح النظيفة، وهي ملقط تشريح واحد، ومقص، ومقص كبير. نستخدم في هذا العمل *plegia California car* من ساحل كاليفورنيا، والتي يبلغ وزنها حوالي 150 grams.

نحتفظ بالحيوانات في خزان كركند لمدة تتراوح بين ثلاثة إلى أربعة أسابيع كحد أقصى. يتم حقن الحيوان بمحلول كلوريد المغنيسيوم في تجويف الجسم بالقرب من الرأس. يساعد تدليك الحيوان على نشر المحلول ويمنعه من الانكماش.

ثبّت الحيوان من الرأس والذيل على لوح من البوليسترين باستخدام إبر محاقن. ارفع عضلة جدار الجسم بملقط واحد وافتح تجويف الجسم باستخدام مقص كبير. بعد ذلك، قص جدار الجسم طولياً على طول الجانب من الرأس إلى الذيل وثبّت العضلة باللوح.

بعد ذلك، يجب تحديد موقع العقدة البطنية أسفل المبيض، وهو عضو مائل للصفرة يشبه الفرشاة. يمكن العثور على العقدة البطنية في هذه المنطقة. افصل العقدة عن طريق قطع الأعصاب باستخدام مقص التشريح من الجانبين الأمامي والخلفي للعقدة.

بعد ذلك، انقل العقدة العصبية إلى أنبوب اختبار يحتوي على 1 mL من المحلول المستبدل وضعها في حمام مائي بدرجة حرارة 22 °C لمدة 15.5 ساعة. خلال هذه الحضنة، سيتراخى النسيج الضام إلى درجة تسمح بإزالة تجمعات الخلايا الخلفية بسهولة. وقبل البدء في زراعة الخلايا الخلفية، سنقوم بتجهيز شرائح التغطية التي ستُزرع عليها العصبونات.

نقوم بزراعة عصبونات الخلايا الخلفية على شرائح غطاء مطلية بـ lyin في أطباق بتري بقطر 35 millimeter. ثم تُغمر هذه الخلايا في وسط L 15 A SW، وهو وسط زراعة عالي الملوحة. وبالنسبة لهذا النوع من الخلايا، نقوم عادةً بتجهيز من ثمانية إلى 10 أطباق بتري تحتوي على شرائح غطاء لكل حيوان.

لنناقش الآن الأدوات المستخدمة في زراعة عصبونات الخلايا الكيسية. لتشريح تجمعات الخلايا الكيسية، سنحتاج إلى ثلاثة أطباق بتري بدون شرائح غطاء مملوءة بـ L 15 A SW، وملقط ومقص دقيقين معقمين بالكحول، وطرف أصفر مثني مثبت بـ P 20 pipe. يتم حرق الطرف الأصفر عن طريق تمريره سريعاً فوق لهب موقد بنزن واستخدام الملقط لثنيه.

توخَّ الحذر لتجنب سحق الجزء المنحني، وإلا فقد تلتصق مجموعة خلايا الكيس لاحقاً في ذلك الموضع. يتم إجراء تشريح وزراعة خلايا كيس plegia في درجة حرارة الغرفة تحت مجهر التشريح.

الآن انتهت فترة تحضين الإنزيم التي استمرت 15.5 hour، ويمكننا نقل العقدة البطنية من مساحة القرص إلى أحد أطباق العمل التي تحتوي على وسط L 15 A SW. وقبل توضيح كيفية عزل الخلايا الكيسية، دعونا نلقِ نظرة أولاً على المخطط التوضيحي. لتصور كيفية تشريح العقدة البطنية، نقوم أولاً بقطع العقدة البطنية من المنتصف.

كما يتضح من هذا الخط، نقوم بعد ذلك بإجراء قصتين في الجزء الأمامي والخلفي من الجهة الخلفية، لتشكيل مجموعة كما ترون هنا.

الآن، وبالنظر عبر المجهر المجسم، يمكنك ملاحظة أن العقدة البطنية قد قُطعت من المنتصف، وتظهر الآن القطعتان في الجانبين الأمامي والخلفي من تجمع خلايا الحقيبة. بعد ذلك، نستخدم الملقط للعثور على فتحة في النسيج الضام، ثم ندفع برفق غمد النسيج الضام المحيط بتجمع خلايا الحقيبة نحو الأسفل. قم بإزالة النسيج الضام من التجمع كقطعة واحدة إن أمكن باستخدام مقص التشريح.

ولكن يجب الحذر من إتلاف عنقود الخلايا الكيسية. باستخدام الوسط الموجود في طرف الماصة المنحني، انقل عنقود الخلايا الكيسية بلطف إلى طبق عمل آخر. ثم قم بلمس عنقود الخلايا الكيسية بلطف باستخدام طرف ماصة أصفر لفصل الخلايا الكيسية الفردية عن العنقود.

للقيام بذلك، اسحب التجمع إلى طرف الماصة ثم ادفعه للخارج دون التسبب في تكوين أي فقاعات هوائية. انقل الخلايا الحية من التجمع إلى أطباق تحتوي على شرائح غطاء مطلية بالبولي-L-لايسين. تظهر الخلايا الميتة باللون الأسود في المركز بينما تظهر الخلايا الحية باللون الأبيض.

من المهم وضع الخلايا في مركز شريحة التغطية المخصصة للفحص المجهري، وإزالة أي حطام خلوي أو خلايا ميتة في أسرع وقت ممكن. ومن خلال التقاط المواد غير المرغوب فيها أو نفخها بعيداً، ستلتصق الخلايا السليمة بسرعة بصفيحة البولي ليسين. يوضع حوالي 15 إلى 25 خلية على كل شريحة تغطية.

عندما يتم وضع جميع الخلايا من المجموعة الأولى، يتم إزالة النسيج الضام من المجموعة الثانية ومتابعة إجراء زراعة الخلايا ذاته. بعد الانتهاء من جميع الأطباق، تُترك في درجة حرارة الغرفة على طاولة المختبر لمدة ساعتين على الأقل للسماح للخلايا بالالتصاق بشكل صحيح مع تجنب أي اهتزازات. بعد ذلك، تُوضع الأطباق في صينية من البوليسترين أو البلاستيك وتُنقل إلى حاضنة بدرجة حرارة 14 درجة قبل الاستخدام اللاحق.

نقوم عادةً بتصوير مخاريط النمو العصبية بعد يوم أو يومين من عملية الزرع. ومن أجل التصوير الحي لديناميكيات مخاريط النمو العصبية، نصنع غرفة تصوير صغيرة مكونة من شريحتين غطائيتين تفصلهما فواصل بلاستيكية. وتكون العصبونات ملتصقة بالشريحة الغطائية السفلية.

يتم قص غطاء الشريحة العلوي ليكون أقصر باستخدام قلم ماسي للسماح بتغيير الوسط بسهولة. بعد ذلك، توضع شريحة الغطاء "الساندوتش" على منصة المجهر داخل حامل مصنع خصيصاً للتثبيت على المجهر. يُستخدم شحم الفراغ العالي الخاص بالمنصة لتثبيت عناصر الغرفة معاً ومنع تسرب الوسط. وباستخدام حقنة صغيرة، يتم وضع شحم الفراغ العالي على غطاء الزجاج العلوي، ثم نستخدم الملاقط لتحديد موضع الفواصل، وبعد ذلك نضع بعض شحم الفراغ في الأعلى.

بعد ذلك، نرفع التجميعة بأكملها، ونقلبها، ونضغط عليها برفق فوق غطاء الشريحة الذي لا تزال الخلايا مغمورة فيه داخل الطبق. نستخدم مسحات قطنية لمحاذاة أغطية الشرائح والضغط على غطاء الشريحة العلوي دون كسره. ثم نزيل "الساندوتش" بعناية من الطبق، ونمسح أي وسط زائد، ونضعه على قاعدة الحامل.

ضع الشريحة الساندوتشية في الحامل مع الحرص على عدم كسر غطاء الشريحة نتيجة الضغط. نظف غطائي الشريحة باستخدام منظف الزجاج "sparkle" على مسحة قطنية (Q-tip)، ونحن نفضل استخدام "sparkle" لأنه يترك آثار تخطيط أقل على الزجاج. نظف غطاء الشريحة بحركة دائرية من المركز، واتبع ذلك مباشرةً باستخدام مسحة قطنية جافة لتجنب ظهور الخطوط.

تعتبر نظافة الزجاج المغطى أمراً بالغ الأهمية للحصول على تصوير عالي الجودة، خاصة عند استخدام بصريات DIC. وتتميز مزارع الخلايا العصبية الظهرية للجذر الخلفي بأنها مزارع منخفضة الكثافة، لذا سيكون من المفيد جداً أن يحتوي المجهر الخاص بك على وظائف تحديد موضع المنصة لتسهيل التنقل بين الخلايا المختلفة. والآن، نحن مستعدون لمراقبة نمو المورفولوجيا الأساسية والقدرة على الحركة.

نقوم بتصوير النمو من حيث المورفولوجيا والقدرة على الحركة باستخدام التصوير بالفاصل الزمني بتقنية تباين التداخل التفاضلي (DIC) عالية الدقة. يُعد تصوير DIC مفيداً لهذا التطبيق لأنه يوفر رؤية سطحية لبنية مخروط النمو في هذا الفيلم بنظام 60 XDIC time-lapse. ويمكن للمرء أن يرى بوضوح المجالات الثلاثة لمخروط النمو النموذجي.

تتكون المنطقة الطرفية من lamellipodia و filopodia، بينما تتميز منطقة الانتقال بنشاط التجعيد (ruffling)، وتحتوي المنطقة المركزية بشكل أساسي على الأنابيب الدقيقة والعضيات. ولدراسة آليات توجيه مخروط النمو، قمنا بتطوير مقايسة التفاعل باستخدام الخرز المقيد (RBI assay) في هذه المقايسة.

تُستخدم الحبيبات الدقيقة المغلفة ببروتينات artesian لمحاكاة ركائز الأهداف الخلوية. توضع الحبيبة على النطاق الطرفي لمخروط النمو باستخدام إبرة مجهرية في فيلم التصوير الزمني بتقنية DIC. يمكن ملاحظة التأثير الارتجاعي والتدفق من خلال الموجات المتحركة تراجعياً في النطاق المركزي.

تتحرك العضيات على الأنيبيبات الدقيقة. بعد فترة أولية لا تحدث خلالها تغيرات ملحوظة، يمكن ملاحظة حركة أمامية مفاجئة لحدود النطاق المركزي باتجاه الخرزة المقيدة. ويمكن ملاحظة نمو في الحافة الأمامية وزيادة في التوتر، بالإضافة إلى تأثير في تخامد التدفق واستطالة الأنيبيبات الدقيقة، وتحديداً على طول محور التفاعل مع الخرزة.

لتحليل ديناميكيات الهيكل الخلوي في المخاريط النمائية، نستخدم مجهر البقع الفلورية. نقوم بحقن مجهري لمجسات tubulin و actin الموصومة فلورياً في جسم الخلية العصبية ونقوم بتصوير مقاطع فيديو بنظام التصوير الزمني. ومن بين الحركات الديناميكية للهيكل الخلوي، يتجمع actin الموضح باللون الأحمر على طول الحافة الرائدة، وينتقل تراجعياً بواسطة التدفق التراجعي، ثم يُعاد تدويره في المنطقة الانتقالية.

استكشفت الأنيبيبات الدقيقة الديناميكية الموضحة باللون الأخضر محيط مخروط النمو من خلال مزيج من سلوك التجميع والانتقال. وتؤدي كمية الوسم المنخفضة إلى ظهور نمط منقط، مما يسمح لنا بتحليل المعلمات المختلفة لديناميكيات الهيكل الخلوي كمياً. لقد عرضنا لكم كيفية إجراء تشريح خلايا العقد القاعدية وزراعتها وتصويرها إذا كنتم ترغبون في إجراء تصوير عالي الدقة لمخاريط النمو العصبية.

إن هذا النظام هو الأنسب للاستخدام نظراً للحجم الكبير للمخاريط النموية، والمناطق السيتوبلازمية المحددة، والهيكل الخلوي الموصوف بدقة. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.