الخلية العصبية من الثقافات Aplysia عن التصوير عالية الدقة من المخاريط النمو

في المختبر الزائف ، نقوم بزراعة الخلايا العصبية للخلايا الخلفية من سيارة Marine Mollusk Plegia California. هذه الخلايا العصبية توقع سلبيات نمو كبيرة جدا ، مما يجعلها نظاما نموذجيا جيدا جدا للدراسات عالية الدقة لحركة النمو والتوجيه ، خاصة لتحليل ديناميكيات الهيكل الخلوي. في هذا الفيديو ، نوضح كيفية إجراء تشريح الشجر وثقافة الخلايا الخلفية.

مرحبا ، أنا دانيال سوتر من قسم العلوم البيولوجية بجامعة بوردو. سنعرض لك اليوم إجراء لثقافة التشريح وتصوير الخلايا العصبية للخلايا الخلفية في البلجي. الخلايا العصبية من C ، وقد استخدمت على نطاق واسع في دراسات التعلم والذاكرة.

نظرا لأن أبيا لديها جهاز عصبي بسيط وخلايا عصبية كبيرة مناسبة للفيزيولوجيا الكهربية. في مختبرنا ، نستخدم هذه الخلايا العصبية لأن مخاريط نموها كبيرة ومناسبة جدا للتصوير عالي الدقة لديناميكيات البروتين المتعلقة بالنمو والحركة والتوجيه. يتضمن الإجراء الكامل الخطوات التالية.

في اليوم الأول ، يتم التضحية بالحيوان وتشريحه للحصول على العقد البطنية. في اليوم الثاني ، يتم تحضير لوحات الثقافة. يتم تشريح مجموعات الخلايا الخلفية ويتم طلاء الخلايا العصبية الفردية.

في اليوم الثالث ، يتم إنشاء غرفة تصوير للتصوير بفاصل زمني للخلايا باستخدام الفحص المجهري للتباين التفاضلي DIC ، وتوضيحها وسردها. سيكون الإجراء اليوم هو iTune Lee ، طالب دراسات عليا في مختبري. ستوضح لك الآن كيفية تحضير الخلايا العصبية الخلوية.

هيا نبدأ. الخلايا العصبية للخلايا الخلفية هي جزء من العقدة البطنية للجهاز العصبي ، لذلك سنقوم بتشريح العقدة البطنية بأكملها من أجل الهضم الأنزيمي. ثم سنفصل مجموعتي الخلايا الكيسية عن بقية العقدة.

سيتم هضم العقدة البطنية في محلول المرحلة الثانية هذا لمدة 15 إلى 16 ساعة لتخفيف الأنسجة الضامة. نحتاج الآن إلى تحضير حقنة كبيرة سعة 60 مليلتر مملوءة ب 0.5 مولار من كلوريد المغنيسيوم للتضحية بالحيوان وتنظيف أدوات التشريح ، وتشريح ملقط واحد ، ومقص ، ومقص كبير. نحن سيارة بري بليجيا كاليفورنيا من ساحل كاليفورنيا ، والتي يبلغ وزنها حوالي 150 جراما.

نحتفظ بالحيوانات في خزان جراد البحر لمدة أقصاها ثلاثة إلى أربعة أسابيع. يتم حقن بالقرب من الرأس في تجويف الجسم بمحلول كلوريد المغنيسيوم. يساعد فرك على نشر المحلول ويمنعه من الانقباض.

قم بتثبيت في الرأس والذيل لأسفل على لوح من الستايروفوم باستخدام إبر المحقنة. ارفع عضلة جدار الجسم بملقط واحد وافتح تجويف الجسم بمقص كبير. ثم اقطع جدار الجسم مفتوحا على طول الجانب من الرأس إلى الذيل وقم بتثبيت العضلة على اللوحة.

بعد ذلك ، يجب العثور على العقدة البطنية أسفل المبيض ، وهو فرشاة مثل العضو المصفر. يمكن العثور على العقدة البطنية. افصل العقدة عن طريق قطع الأعصاب بمقص التشريح على الجانب الأمامي والخلفي من العقدة.

ثم انقل العقدة إلى أنبوب اختبار مع ملليلتر واحد من المحلول النازح وضعه في حمام مائي بدرجة حرارة 22 درجة لمدة 15.5 ساعة. خلال هذه الحضانة ، سوف يتحلل النسيج الضام إلى نقطة يمكن فيها إزالة مجموعات الخلايا الخلفية بسهولة. قبل البدء في زراعة الخلايا الخلفية ، سنقوم بإعداد زلات الغطاء التي يتم زراعة الخلايا العصبية عليها.

نحن نزرع الخلايا العصبية الخلوية الخلفية على زلات غطاء مغلفة باللين في أطباق بتري 35 ملم. ثم يتم غمرها في وسط L 15 A SW ، وهو وسط ثقافة عالي الملح. بالنسبة لهذا النوع من الخلايا ، نقوم عادة بإعداد ثمانية إلى 10 أطباق بتري مع زلات غطاء لكل.

الآن دعونا نناقش الأدوات المستخدمة لطلاء الخلايا العصبية لخلايا الكيس. لتشريح مجموعات خلايا الكيس ، سنحتاج إلى ثلاثة أطباق خوخية بدون غطاء مليء ب L 15 A SW ، ملقط ناعم ومقص معقم بالكحول وطرف أصفر منحني متصل بأنبوب P 20. يتم حرق الطرف الأصفر عن طريق تمريره بسرعة فوق لهب موقد بنسون واستخدام ملقط لثنيه.

احرص على عدم سحق جزء الانحناء. خلاف ذلك ، قد تتعثر مجموعة خلايا الكيس هناك لاحقا. يتم تشريح وطلاء خلايا كيس plegia في درجة حرارة الغرفة تحت نطاق التشريح.

الآن انتهت حضانة الإنزيم لمدة 15.5 ساعة ويمكننا نقل العقدة البطنية من مساحة القرص إلى أحد أطباق العمل مع وسط L 15 A SW. قبل إظهار كيفية عزل خلايا الكيس ، دعنا أولا نلقي نظرة على التخطيطي. لتصور كيفية تشريح العقدة البطنية ، قمنا أولا بقطع العقدة البطنية من خلال المركز.

كما ترون من خلال هذا السطر. ثم نقوم بعمل قطعتين أمام وخلف الظهر. لذا قم بالتجميع كما ترون هنا.

الآن بالنظر من خلال المجسم ، يمكنك أن ترى أن العقدة البطنية مقطوعة من خلال المركز والآن يمكنك أن ترى أن الجرحين يتم إجراؤهما في الجزء الأمامي والخلفي من مجموعة الخلايا الخلفية. ثم نستخدم الملقط لإيجاد فتحة في النسيج الضام وندفع بلطف غمد النسيج الضام المحيط بمجموعة الخلايا الكيسية. قم بإزالة النسيج الضام من الكتلة كقطعة واحدة إن أمكن باستخدام مقص التشريح.

لكن احرص على عدم إتلاف مجموعة خلايا الكيس. باستخدام وسيط مأخوذ في الطرف المنحني ، انقل مجموعة خلايا الكيس برفق إلى طبق عمل آخر. قم ببرفق بتجميع خلايا الكيس بطرف أصفر لإزالة خلايا الكيس الفردية من المجموعة.

للقيام بذلك ، خذ المجموعة إلى طرف الماصة وادفعها للخارج دون التسبب في أي فقاعات هواء. انقل الخلايا الحية من الكتلة إلى الأطباق التي تحتوي على شرائح غطاء مطلية بالبولي. تظهر الخلايا الميتة باللون الأسود في الوسط بينما تكون الخلايا الحية بيضاء.

من المهم وضع الخلايا في وسط زلة الغطاء للفحص المجهري وإزالة أي بقايا خلية وخلايا ميتة في أسرع وقت ممكن. عن طريق التقاط المواد غير المرغوب فيها أو نفخها بعيدا ، سوف تلتصق الخلايا السليمة بسرعة بلوحة البولي ليسين. حوالي 15 إلى 25 خلية في كل زلة غطاء.

عندما يتم وضع جميع الخلايا من المجموعة الأولى ، تتم إزالة النسيج الضام للمجموعة الثانية ويستمر نفس إجراء طلاء الخلية. بعد الانتهاء من جميع الألواح ، اتركها تجلس في درجة حرارة الغرفة في مقعد الأرضية لمدة ساعتين على الأقل للسماح للخلايا بالالتصاق بشكل صحيح مع تجنب أي اهتزازات. ثم ضع الأطباق على ستايروفوم أو صينية بلاستيكية وانقلها إلى حاضنة 14 درجة قبل الاستخدام مرة أخرى.

عادة ما نصور مخاريط نمو plegia بعد يوم أو يومين من الطلاء. لتصوير نمط الحياة لديناميكيات مخروط نمو الخلايا العصبية ، نقوم بعمل غرفة تصوير صغيرة من زلات غطاء مفصولة بمساحات بلاستيكية. يحتوي زجاج الغطاء السفلي على الخلايا العصبية المتصلة بها.

يتم قطع زلة الغطاء العلوي بشكل أقصر باستخدام قلم ماسي للسماح بسهولة التبادل المتوسط. في مرحلة المجهر ، يتم بعد ذلك وضع شطيرة زلة الغطاء في حامل مخصص للتركيب على المجهر. يتم استخدام الشحوم ذات الفراغ العالي للمرحلة لتثبيت عناصر الغرفة معا دون تسرب متوسط باستخدام حقنة صغيرة ، يتم تطبيق الشحوم ذات الفراغ العالي على زجاج الغطاء العلوي ثم نستخدم ملقطا لوضع الفراغات ثم نضع بعض الشحوم المفرغة في الأعلى.

ثم نلتقط المجموعة بأكملها ، ونقلبها ونضغط عليها برفق على الغطاء ، مع استمرار غمر الخلايا في الطبق. استخدم Q-tips لمحاذاة زلات الغطاء واضغط على زلة الغطاء العلوي لأسفل دون كسره. ثم نزيل الساندويتش بعناية من الطبق ، ونمسح أي وسيط إضافي ونضعه على قاعدة الحامل.

ضع الساندويتش في الحامل دون تكسير زجاج الغطاء بالضغط. قم بتنظيف كلا الزجاجين الواقيين باستخدام منظف الزجاج اللامع على طرف Q ونفضل استخدام التألق لأنه يترك خطوطا أقل على الزجاج. نظف الزجاج المغطى بحركة دائرية من المركز واتبعه على الفور بطرف Q جاف لتجنب الخطوط.

الزجاج المغطى النظيف مهم جدا للتصوير عالي الجودة ، خاصة مع بصريات DIC. المزارع العصبية للخلايا الخلفية البلحالة هي مزارع منخفضة الكثافة ، لذلك سيكون من المفيد جدا أن يحتوي المجهر الخاص بك على وظائف تحديد موقع المرحلة لسهولة التبديل بين الخلايا المختلفة. الآن نحن مستعدون لمراقبة مورفولوجيا النمو الأساسية والحركة.

نحن نتصور النمو في التشكل والحركة مع تباين التداخل التفاضلي عالي الدقة ، والتصوير بفاصل زمني DIC. يعد تصوير DIC مفيدا لهذا التطبيق لأنه يوفر عرضا سطحيا لهيكل النمو في فيلم 60 XDIC بفاصل زمني. يمكن للمرء أن يرى بوضوح المجالات الثلاثة لمخروط النمو النموذجي.

المجال المحيطي الذي يتكون من يؤثر على إثراء لا ميلا بوديا, و op podia. المنطقة الانتقالية التي تتميز بنشاط الكشكشة والمجال المركزي الذي يحتوي بشكل أساسي على الأنابيب الدقيقة والعضيات. لدراسة آليات توجيه النمو ، قمنا بتطوير مقايسة RBI لتفاعل الخرزة المقيدة في هذا الفحص.

تستخدم الميكروبيدات المغلفة بالبروتينات الارتوازية لتقليد الركائز الخلوية المستهدفة. يتم وضع الخرزة على المجال المحيطي لمخدع النمو باستخدام إبرة دقيقة في فيلم DIC بفاصل زمني. يمكن للمرء أن يرى التأثير والتدفق الرجعي عن طريق الموجات المتحركة الرجعية في المجال المركزي.

تتحرك العضيات على الأنابيب الدقيقة. بعد فترة أولية لا تحدث خلالها تغييرات كبيرة ، يمكن للمرء أن يرى حركة مفاجئة إلى الأمام لحدود المجال المركزي باتجاه الخرزة المقيدة. يمكن ملاحظة رفيق من خلال النمو الرائد وزيادة التوتر بالإضافة إلى تأثير توهين التدفق وتمديد الأنبوب الصغير على وجه التحديد على طول محور تفاعل الخرزة.

لتحليل ديناميكيات الهيكل الخلوي في مخاريط النمو ، نستخدم الفحص المجهري للبقع الفلورية. نقوم بحقن التوبولين المصنف بالفلورسنت والمجسات المؤثرة في جسم الخلية العصبية ونلتقط أفلاما بفاصل زمني. من بين الحركات الديناميكية للهيكل الخلوي ، يتم تجميع التأثير الموضح باللون الأحمر على طول الحافة الأمامية للرصاص المرتجع المنقول عن طريق التدفق المرتجع وإعادة تدويره في المنطقة الانتقالية.

استكشفت البوق الصغير الديناميكي الموضح باللون الأخضر محيط النمو من خلال مزيج من سلوك التجميع والنقل. ينتج عن انخفاض كمية الملصقات النمط المرقط ، مما يسمح لنا بتحليل المعلمات المختلفة لديناميكيات الهيكل الخلوي كميا. لقد أوضحنا لك كيفية إجراء تشريح الخلايا الخلفية والثقافة والتصوير إذا كنت ترغب في إجراء تصوير عالي الدقة لمخاريط نمو الخلايا العصبية.

هذا هو النظام الذي يجب استخدامه حقا بسبب الحجم الكبير لمخاريط النمو ، وتحديد المناطق السيتوبلازمية والهيكل الخلوي الموصوف جيدا. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.