Name: عزل خلايا مولر الدبقية الدبقية لشبكية الفأر الأولية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: تعلم عزل خلايا مولر الدبقية من شبكية الفأر باستخدام التربسين والتنمية في الوسط المناسب. تتيح هذه الطريقة دراسة أدوار هذه الخلايا في أمراض الشبكية وتطوير أهداف علاجية محتملة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعيون (NEI) ، صندوق المعهد الوطني للعيون (NEI) R01 EY029751-04. نود أن نعرب عن تقديرنا للدكتورة سيلفيا ب. سميث حيث تم تعديل هذا البروتوكول بناء على بروتوكولها الخاص بعزل خلايا مولر.

تتوافق جميع التجارب مع مع بيان ARVO لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية وتم إجراؤها وفقا لبروتوكول المعتمد من قبل معهد رعاية ولجنة استخدامه (IACUC) وسياسات جامعة أوكلاند (رقم البروتوكول 2022-1160)
1. وسائل الإعلام وإعداد الحلول
<ol><li>تحضير محلول عين خلية مولر عن طريق استكمال وسط النسر المعدل Dulbecco (DMEM ، التفاصيل في جدول المواد) مع البنسلين / الستربتومايسين بتخفيف 1: 1000. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 10 مل من DMEM ، أضف 10 ميكرولتر من البنسلين / الستربتومايسين. ملاحظة: هذه وسائط بسيطة خالية من المصل تم إعدادها. أيضا ، قم بتسخين الوسائط الكاملة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية قبل استخدامه لعمل زراعة الخلايا.</li>
	<li>تحضير وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة عن طريق استكمال DMEM بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS ، معطل بالحرارة) ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. على سبيل المثال (500 مل من وسائط DMEM + 50 مل من FBS + 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين).</li>
	<li>تحضير محلول Trypsin-EDTA بنسبة 0.05٪ مع كولاجيناز IV بتركيز 200 وحدة / مل (يستخدم Trypsin-EDTA لإذابة الكمية المحسوبة من مسحوق Collagenase IV للوصول إلى التركيز المطلوب).</li>
</ol>2. الاستئصال
<ol><li>القتل الرحيم للفأر أخلاقيا باستخدام استنشاق CO2 باتباع إرشادات IACUC.<ol><li>باختصار ، ضع () في غرفة CO2 لإدخال 100٪ CO2 بمعدل ملء 30-70٪ من حجم الغرفة / دقيقة مع CO2 لتحقيق هدف فقدان الوعي السريع في غضون 2-3 دقائق مع الحد الأدنى من الضيق للفئران.</li>
		<li>نظرا لأن الفئران في سن مبكرة (~ 10 أيام) ، فقم بإجراء خلع عنق الرحم كطريقة ثانوية لضمان القتل الرحيم المناسب.</li>
	</ol></li>
	<li>بعد تعقيم منطقة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ضع الماوس على وسادة سفلية معقمة.</li>
	<li>اقتطع العينين عن طريق وضع أذرع الملقط في الجزء الخلفي من العين ، والسحب برفق من المنطقة المدارية ، واستئصال العينين عن طريق الضغط باستخدام ملاقط نمط 5/45 على المنطقة المدارية لإحداث البروبتوس. ملاحظة: تعقيم أدوات التشريح ب 70٪ إيثانول متبوعا بمحلول ملحي عازل للفوسفات قبل التشريح.</li>
	<li>تأكد من أن العصب البصري لا يزال متصلا بالعين عن طريق استئصال العين ببطء. تأكد من سحب العصب البصري (المعروف بصريا على أنه حبل أبيض) خلف العين. ملاحظة: لا يلزم إجراء هذه الخطوة تحت المجهر ، ويمكن إجراؤها على مقعد معقم.</li>
</ol>3. علاج العيون المنزوعة النواة
<ol><li>قم بتغطية أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل بورق الألمنيوم واملأ الأنبوب ب 10 مل من محلول عين خلية مولر.</li>
	<li>ضع العيون المقطعة في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على محلول عين خلية مولر واسمح لهما بالجلوس طوال الليل ، أو حوالي 18 ساعة ، في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>بعد 18 ساعة ، صب محلول العين وشطف العينين لفترة وجيزة مع 2-3 مل من المياه المالحة الدافئة (37 درجة مئوية) الفوسفاتية (PBS).</li>
	<li>صب برنامج تلفزيوني وحرك العينين إلى طبق بتري 100 مم يحتوي على 10 مل من محلول التربسين. (أعدت في الخطوة 1-3). ملاحظة: يستخدم التربسين على العين المنزوعة النواة بالكامل ، ويعمل كعامل انفصامي لتسهيل فصل الخلايا عن طبقات الشبكية أثناء التسلخ. تحتوي شبكية العين المقطعة على العديد من الخلايا ، بما في ذلك خلايا RPE ، وهي لزجة ومن المرجح أن تلوث مزرعة خلايا مولر14. أظهر الفحص المجهري بوضوح أنه بعد 5 أيام من العزلة (أثناء تغيير الوسائط الأول) ، انفصلت خلايا RPE عن اللوحة وماتت13. الوسائط المستخدمة لعزل RPE هي DMEM / F-12 ، بتركيبة مختلفة عن DMEM (المستخدمة في عزل خلايا مولر) ، والتي تحتوي على بيروفات الصوديوم وانخفاض الجلوكوز.</li>
	<li>ضع الطبق في حاضنة واحتضانه لمدة 1.5 إلى 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
	<li>بعد الحضانة ، انقل العينين إلى طبق بتري 60 مم يحتوي على ما يقرب من 5 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة.</li>
</ol>4. تشريح
ملاحظة: يجب تنفيذ هذا الإجراء في البيئة المعقمة لغطاء الثقافة. وبالتالي ، من الضروري تعقيم أسطح غطاء المحرك تماما بنسبة 70٪ كحول ، إلى جانب جميع الأدوات ومجهر التشريح. تجدر الإشارة إلى أنه تم تسجيل الفيديو خارج غطاء المحرك للحصول على رؤية أفضل وأغراض توضيحية أوضح.
<ol><li>ضع قطعة صغيرة من الأنسجة المعقمة من فئة المختبر في الطبق للمساعدة في استقرار العينين أثناء التسلخ. ضع العينين تحت مجهر تشريح لبدء التشريح. ملاحظة: يسهل استخدام الأنسجة المعملية مناورة العينين في طبق مملوء بالسوائل (وسائط كاملة) ، مما يضمن تشريحا دقيقا.</li>
	<li>استخدم مقص Vannas وملاقط على غرار M5S لإزالة النسيج الضام وعضلات العين والعصب البصري.<ol><li>أمسك العين باستخدام ملاقط على غرار M5S وقم بعمل شق في قسم ora serrata بمقص Vannas أو إبرة حقنة. ملاحظة: يوجد خط دائري أزرق فاتح بين الجزء الأمامي والخلفي من العين يسمى ora serrata ، والذي يمكن استخدامه كمعلم للتوجيه الدقيق أثناء التسلخ.</li>
		<li>أمسك الشق باستخدام ملاقط على غرار M5S واسحب القرنية أو تمزقها من الجزء الخلفي من العين. اسحب زيادات صغيرة لضمان بقاء سلامة الشبكية سليمة. ملاحظة: هذه الخطوات هي لإزالة الجزء الأمامي من العين (القرنية والقزحية والعدسة) من الجزء الخلفي من كأس العين (شبكية العين العصبية والمصطبغة).</li>
		<li>للحفاظ على سلامة طبقات الشبكية ، اسحب برفق وإزالة ظهارة الشبكية المصطبغة من الشبكية العصبية. يجب أن تكون الشبكية العصبية خالية من أي بقع سوداء لضمان نقاء العزل قدر الإمكان ، حيث أن طبقة RPE عادة ما تكون لزجة ومتصلة بالشبكية العصبية.</li>
		<li>قطع شبكية العين العصبية تشريح إلى قطع صغيرة قبل جمعها في لوحة لضمان انتشار متجانس للخلايا على اللوحة.</li>
	</ol></li>
	<li>صفيحة شبكية العين العصبية في دورق T25 يحتوي على 4 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة.</li>
	<li>أخيرا ، ضع القارورة في حاضنة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
</ol>5. زراعة خلايا مولر الدبقية الأولية
<ol><li>لا تحرك القارورة لمدة 3-5 أيام لتعزيز نمو الخلايا.</li>
	<li>قم بتغيير الوسائط بعد اليوم الخامس وكل يومين بعد ذلك حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 90٪.</li>
</ol>6. تمرير خلايا مولر الدبقية الأولية
<ol><li>نضح وسائط زراعة خلايا مولر ، متبوعا ب 2 مل من الغسيل في برنامج تلفزيوني ، واستنشاق PBS. أضف 2 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA (1x) ، أو ما يكفي لتغطية اللوحة.</li>
	<li>احتضان لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تأكد من فصل الخلايا عن اللوحة تحت المجهر. بعد ذلك ، اجمع معلق الخلية وأضف 4 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة (المحضرة في الخطوة 1.2) إلى أنبوب التجميع.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 300 × غرام. بعد شفط المادة الطافية، أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة. نظرا لأن عدد الخلايا يمكن أن يختلف وفقا لعدد العيون التي تم تشريحها ، فمن الأفضل حساب الخلايا قبل البذر والحضانة. كثافة البذر الموصى بها هي 3.0 × 106 خلايا في قارورة T75. ملاحظة: يمكن تمرير الخلايا حتى 4-5 مرات. ومع ذلك ، تم العثور على نتائج التجربة الأكثر اتساقا بعد 1-2 مقاطع.</li>
</ol>7. التألق المناعي
ملاحظة: استخدم بروتوكول التألق المناعي لتلطيخ خصوصية خلية مولر والتحقق من صحتها. فيما يلي لمحة موجزة عن بروتوكول الفلورسنت المناعي. يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد المقطع الأول12.
<ol><li>قم بزرع الخلايا في شريحة غرفة زراعة الخلايا (30000 خلية لكل بئر لشريحة غرفة ذات 8 آبار).</li>
	<li>استزراع الخلايا المعزولة لمدة 24-48 ساعة في وسط زراعة خلايا مولر الكامل (محضر في الخطوة 1.2) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
	<li>قم بنضح الوسائط وغسل شريحة الغرفة ب 250-300 ميكرولتر من 1x PBS على كل بئر عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80-90٪.</li>
	<li>ثبت الشريحة لمدة 10 إلى 15 دقيقة في 250-300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد على كل بئر ، متبوعا بالغسيل باستخدام PBS / TX-100 (5 دقائق لكل منهما / 3x).</li>
	<li>أضف حاجزا حاجزا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية (انظر جدول المواد).</li>
	<li>نضح محلول الحجب ، ثم أضف الأجسام المضادة الأولية الخاصة بخلايا مولر لتأكيد نقاء الخلايا المعزولة باستخدام إنزيم الجلوتامين سينثيتاز وفيمنتين5،12. احتضان لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية (باستخدام تركيز الأجسام المضادة من 1: 100-1: 200 في حجب المخزن المؤقت في حجم 150-200 ميكرولتر / شريحة). اغسل الشريحة بغسلة PBS / TX-100 (5 و 10 دقائق لكل منهما). ملاحظة: تم اختيار هذه الأجسام المضادة لأنها علامات مميزة لتحديد خلايا مولر وضمان نجاح ونقاء مزرعة خلايا مولر.</li>
	<li>أضف الجسم المضاد الثانوي (بتركيز جسم مضاد يتراوح من 1: 1000 في المخزن المؤقت المانع في 150-200 ميكرولتر / شريحة) واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل باستخدام PBS / Triton X-100 ، ثلاث مرات (5-10 دقائق لكل منهما).</li>
	<li>ضع قطرة من وسيط تركيب DAPI لتسمية النوى قبل تغطية الشريحة بغطاء سليب. تجنب فقاعات الهواء عند وضع غطاء الغطاء.</li>
	<li>استخدم مجهر الفلورسنت للتحقق من الشريحة والتقاط الصور (انظر جدول المواد). ملاحظة: توجد الخلايا باستخدام DAPI عند ex / em 359/461 عند تكبير 10x لتحديد موقع الخلايا ؛ يمكن للتكبير العالي التقاط الخلايا. تعتمد الأطوال الموجية الأخرى على اللون المختار. اللون الأخضر (GFP) - ex / em 488/510. اللون الأحمر (Cy3) - ex / em 555/569.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signaling+in+m%C3%BCller+glia%3A+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophth%22%5BJournal%5D)">Cellular signaling in müller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109(2019).</li>
<li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+M%C3%BCller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Beyoglu+Eye+J%22%5BJournal%5D)">Importance of Müller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li>
<li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+M%C3%BCller+cell+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse Müller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).</li>
<li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Ret+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Müller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li>
<li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina%3A+neurotransmitters+and+trophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li>
<li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Müller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+%28Danio+rerio%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997(2018).</li>
<li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+isolated+glial+%28M%C3%BCller%29+cells+from+the+turtle+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of isolated glial (Müller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li>
<li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+membrane+component+1+%28PGRMC1%29+expression+in+murine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li>
<li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12-HETE+activates+M%C3%BCller+glial+cells%3A+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29%5BTitle%5D)+AND+%22Prostag+Oth+Lipid+M%22%5BJournal%5D)">12-HETE activates Müller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805(2024).</li>
<li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine%2C+rats+and+mice+m%C3%BCller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice müller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7(2020).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عن صلة بمحتوى هذه المقالة.

تم توثيق عزل ظهارة الشبكية المصطبغة الأولية (RPE) من الفئران سابقا من قبل مختبرنا. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا توضيحيا مفصلا لعزل خلايا مولر الأولية. يتضمن هذا الإجراء الاستئصال والعلاج والتشريح والجمع والبذر والثقافة وتوصيف خلايا مولر المعزولة من عيون الفئران. يعتمد على بروتوكول ناجح سابقا موجود في المنشورات السابقة وبروتوكولنا المعدل الذي استخدمناه في منشور حديث1 2,13. في حين أن الخطوات واضحة ومباشرة، فإن عزل خلايا مولر الناجح يتطلب الالتزام بقيود محددة ومتطلبات أساسية. بعد العديد من محاولات التجربة والخطأ لتحسين هذا البروتوكول ، تم تحديد عوامل متعددة تؤثر على نجاحه.
تم العثور على عمر الفأر المثالي ، كما لوحظ في تجاربنا ، ما بين 5-11 يوما من أجل نمو الخلايا المعزولة حتى أربعة ممرات. تتأثر الثقافة أيضا بعدد العيون المعزولة والمثقفة. للعزل الفردي ، يلزم وجود عينين على الأقل للحصول على عدد كاف من الخلايا لتكون قادرة على النمو والتكاثر. جانب آخر مهم هو المدة بين الاستئصال والطلاء. لذلك ، يجب تنفيذ هذه الخطوة بسرعة نسبيا. وقد لوحظ أن التلاعب المطول بأنسجة العين له تأثير ضار على قدرة الخلايا على الالتصاق بالقارورة والتكاثر. للتأكد من أن قرب الخلايا المعزولة قريب بما يكفي لتشجيع الانتشار ، ننصح باستخدام قارورة T25. بمجرد عمل المقطع الأول ، يمكن طلاء الخلايا على T75. أيضا ، لا ينبغي إزعاج الخلايا بعد العزلة والبذر عن طريق إزالة قارورة زراعة الأنسجة من الحاضنة أو عن طريق تبديل الوسائط لمدة 5 أيام على الأقل. أخيرا ، لا يمكن تمرير الخلايا إلا أربع مرات قبل أن تتوقف عن الالتصاق. على الرغم من أن هذا الإجراء مباشر وسهل التنفيذ ، إلا أنه يحتوي على بعض القيود بما في ذلك أعمار الفئران ، وعدد محدود من ممرات الخلايا ، وما إلى ذلك.
لا توجد العديد من البروتوكولات لعزل خلايا مولر ، ولكن هناك بعض الاختلافات الملحوظة من هذا البروتوكول إلى البروتوكولات المتوفرة 5,14. أولا ، يختلف الوقت بين الاستئصال والعزلة اختلافا كبيرا. تشير البروتوكولات الأخرى إلى التشريح بعد فترة وجيزة من الاستئصال ، عادة في غضون 10 دقائق. في حين أن البروتوكول الحالي يشير إلى فترة راحة لا تقل عن 18 ساعة لأن هذا يوفر أفضل النتائج للعزل في هذا البروتوكول. الفرق المهم الآخر بين هذا البروتوكول والبروتوكولات الأخرى هو النقطة التي يتم فيها التعامل مع العينين بالإنزيمات. في هذا البروتوكول ، يتم علاج العينين قبل إجراء أي تشريح ، حتى قبل إزالة النسيج الضام وعضلات العين. بينما تقوم بروتوكولات أخرى بعزل شبكية العين عن العين قبل العلاج بالإنزيم. علاوة على ذلك ، فإن وصفة الإنزيم مختلفة أيضا. في هذا البروتوكول ، يتكون محلول الإنزيم من التربسين والكولاجيناز من النوع الرابع. في بروتوكولات مماثلة ، يتم استخدام غراء و DNase لهضم الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن وعاء الاستزراع مختلف ، يقترح هذا البروتوكول الاستزراع على T25 ثم على T75 بعد الممر الأول. بينما تستخدم البروتوكولات الأخرى أطباق بتري أو أطباق متعددة الآبار. أخيرا ، يشير هذا البروتوكول إلى أنه لا ينبغي إزعاج القارورة (لمدة 5-7 أيام) لتعزيز نمو الخلايا. بينما في البروتوكولات الأخرى يتم إجراء تغيير الوسائط بعد يوم واحد.

خلايا مولر (MCs) هي الخلايا الدبقية الرئيسية والأكثر وفرة الموجودة في أنسجة الشبكية. هم اللاعبون الرئيسيون في توفير السلامة الهيكلية ووظائف التمثيل الغذائي داخل شبكية العين1. ينتشر الهيكل الاستراتيجي ل MCs عبر سمك الشبكية بالكامل ، مما يوفر الدعم لشبكية العين. بالإضافة إلى خصائصها الشبيهة بالسقالات ، فإن لها وظائف التمثيل الغذائي للخلايا العصبية في شبكية العين ، وتزودها بركائز الطاقة ، بما في ذلك الجلوكوز واللاكتات. هذه الوظائف حاسمة من أجل الحفاظ على وظيفة عصبية صحية. تم الإبلاغ عن ضعف MCs للمساهمة في أمراض الشبكية المختلفة ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، واعتلال الشبكية السكري ، والزرق2،3. يمكن أن تكون MCs مصادر خلوية داخلية للعلاج التجديدي في شبكية العين1. كما أنها تشكل جزءا كبيرا من شبكية العين ، وتشير الأدلة القوية إلى أنه في العديد من الأنواع ، يمكن تحفيز هذه الخلايا لتحل محل الخلايا العصبية المفقودة2. فهي تتعاون بشكل مفيد مع الخلايا العصبية ، وتفتح أقدام نهاية خلايا مولر المتفرعة مخروطيا الأوعية الدموية بكثافة وتربط المكونات العصبية لشبكية العين. من أجل الحفاظ على تطور الخلايا العصبية واللدونة العصبية ، تعمل خلايا مولر كركيزة ناعمة للخلايا العصبية ، وتحميها من الصدمات الميكانيكية3. بالإضافة إلى ذلك ، في ظل الظروف المرضية ، قد تتمايز خلايا مولر إلى أسلاف عصبية أو خلايا جذعية تكرر أو تجدد المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية المفقودة2،3،4. تحتفظ خلايا مولر بخصائص الخلايا الجذعية الشبكية ، بما في ذلك مستويات مختلفة من إمكانات التجديد الذاتي والتمايز 5,6. تحتوي خلية مولر الدبقية على سلالة شبكية كبيرة تنتج عوامل التغذية العصبية ، وتمتص وتعيد تدوير الناقلات العصبية ، وتخزن الأيونات مكانيا ، وتحافظ على حاجز الدم والشبكية من أجل الحفاظ على شبكية العين في التوازن7،8،9. هذا يسلط الضوء على إمكانات خلايا مولر كأداة واعدة في العلاجات القائمة على الخلايا لعلاج الأمراض المتعلقة بتنكس الشبكية. خلايا مولر هي الخلايا الدبقية الأولية الموزعة في جميع أنحاء شبكية العين ، وتتصل بكل من الخلايا العصبية والأوعية الدموية. إنها تلعب دورا وقائيا حاسما ، حيث توفر الدعم الهيكلي والأيضي الأساسي للحفاظ على صلاحية واستقرار خلايا الشبكية. لسوء الحظ ، تم العثور على عدد قليل جدا من البروتوكولات في الأدبيات الخاصة بعزل خلايا مولر الأولية من شبكية العين10,11.
نقدم نهجا محسنا لعزل وزراعة خلايا مولر الأولية للفأر بشكل موثوق. تم استخدام هذا البروتوكول في مجموعتنا لعزل خلايا مولر من الفئران من النوع البري C57BL / 6 والفئران المعدلة وراثيا12,13. يتم استخدام الفئران التي تتراوح أعمارها بين 5 و 11 يوما ، دون تفضيل الجنس ، لهذا البروتوكول. تم تمرير الخلايا حتى 4 مرات. ومع ذلك ، في P4 يتوقفون عن الالتزام بالقارورة ، ويصبح من الصعب تنمية ثقافة صحية. غالبا ما تكون المزرعة ملوثة بالخلايا الظهارية المصطبغة في شبكية العين (RPE) ، لذلك يجب تمرير الخلايا مرة واحدة على الأقل قبل إجراء أي تجارب إضافية على خط الخلية. يسمح المرور بمزيد من العزل عن الملوثات. لذلك ، يوفر البروتوكول المقدم طريقة سريعة وفعالة لعزل خلايا مولر الفأرية ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك كمنصة موثوقة للبحث عن الأهداف العلاجية وتقييم العلاجات المحتملة لأمراض الشبكية14.

<table><tbody><tr><td>دورق : 100 مل</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>كولاجيناز IV &nbsp ؛</td><td>ورثينجتون&nbsp;</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>ماصات نقل متدرجة يمكن التخلص منها: 3.2 مل معقمة</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) &nbsp ؛</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media لتنمية M & uuml. ller Cells&nbsp;</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنينية (FBS)</td> <td>gibco</td><td>26140079</td><td>لوسائط زراعة خلايا مولر الكاملة</td></tr> إشارات خلية <tr><td>الجلوتامين</td><td></td><td>سينسيز 80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 حاضنة</td><td>حراري علمية</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok مع إبرة متصلة 21 جم × 1 1/2 بوصة ، معقمة ، للاستخدام الفردي ، 3 مل</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب الطرد المركزي الصغير: 2 مل</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>للحصول على M & uuml الكامل ؛ وسائط ثقافة الخلايا ller</td></tr><tr><td>محلول ملحي للفوسفات العازلة (PBS) Thermo</td> <td>Scientific</td><td>J62851. ملاقط العمل الإيجابي AP</td><td></td></tr><tr><td>، نمط 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>مقص قزحية قياسية مستقيمة 11.5 سم</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 الطرد المركزي</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 مجهر</td><td>Zeiss</td><td>n / A</td><td></td></tr><tr><td>شفرة جراحية ، # 11 ، الفولاذ المقاوم</td> للصدأ <td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>طبق ثقافة التعليق 60 مم × 15 مم طبق</td><td></td> ثقافة <td>الأنسجة 430589</td><td></td></tr><tr><td>Corning: 100x20mm نمط</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الإعصار: 15 مل</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الإعصار: 50 مل</td><td>ملاقط Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>5 مللي ثانية ، 8.2 سم ، مستقيم ، 0.09 × 0.05 مم نصائح</td><td>دومونت</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط نمط العمل الإيجابي 5 ، بيولوجي ، Dumostar ، لمسة نهائية مصقولة ، 110 مم OAL</td><td>علوم المجهر الإلكتروني Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Underpads ، معتدلة: 23 × 36 بوصة</td> <td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>مقص زنبركي Vannas - 2.5 مم حافة القطع</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin &nbsp ؛</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n / a</td><td></td></tr></tbody></table>

عزل خلايا مولر الدبقية الدبقية لشبكية الفأر الأولية

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

الخلية الداعمة الأساسية للشبكية هي خلية مولر الدبقية في شبكية العين. وهي تغطي سطح الشبكية بالكامل وهي قريبة من كل من الأوعية الدموية في شبكية العين والخلايا العصبية في شبكية العين. بسبب نموها ، تؤدي خلايا مولر العديد من المهام الحاسمة في شبكية العين السليمة ، بما في ذلك امتصاص وإعادة تدوير الناقلات العصبية ومركبات حمض الريتينويك والأيونات (مثل البوتاسيوم K +). بالإضافة إلى تنظيم تدفق الدم والحفاظ على حاجز الدم والشبكية ، فإنها تنظم أيضا عملية التمثيل الغذائي وتزويد الشبكية بالمواد المغذية. يتم تقديم إجراء ثابت لعزل خلايا مولر الفأر الأولية في هذه المخطوطة. لفهم العمليات الجزيئية الأساسية التي تنطوي عليها نماذج الفئران المختلفة لاضطرابات العين بشكل أفضل ، يعد عزل خلايا مولر نهجا ممتازا. تحدد هذه المخطوطة إجراء مفصلا لعزل خلايا مولر عن الفئران. من الاستئصال إلى البذر ، تستغرق العملية برمتها حوالي بضع ساعات. لمدة 5-7 أيام بعد البذر ، لا ينبغي تغيير الوسائط للسماح للخلايا المعزولة بالنمو دون عوائق. يأتي توصيف الخلايا باستخدام التشكل وعلامات الفلورسنت المناعية المميزة بعد ذلك في هذه العملية. الحد الأقصى للممرات للخلايا هي 3-4 مرات.

التحقق من خصوصية ونقاء ووظيفة الحاجز لخلايا مولر المعزولة لتأكيد الصلاحية والتشكل والصفات المميزة لخلايا مولر المعزولة ، تم فحص الخلايا تحت المجهر الضوئي. تم تسجيل صور P0 و P1 (الشكل 1A). للتحقق من تلوث خلايا مولر المعزولة بخلايا RPE والتأكد من نقائها ، تم إجراء تلطيخ التألق المناعي (IF) باستخدام أجسام مضادة خاصة بعلامة خلايا RPE ، RPE65. تم استخدام الخلايا المصطبغة في شبكية العين البشرية (ARPE -19) كعنصر تحكم إيجابي. تظهر خلايا RPE الملطخة RPE65 (الأحمر والأزرق للتلطيخ النووي) في الشكل 1B (اللوحة السفلية). لم تلطخ الأجسام المضادة المحددة RPE65 خلايا مولر المعزولة (الشكل 1B ، اللوحة العلوية). حقيقة أن RPE65 لطخت خلايا ARPE-19 (حمراء) ولم تلطخ الخلايا المعزولة ، تشير إلى أن الخلايا المعزولة ليست خلايا RPE. إن وجود البيروفات وانخفاض الجلوكوز في الوسائط يخلق ظروفا غير مواتية لنمو خلايا RPE. وبالتالي ، حتى في حالة تلوث خلايا RPE ، فإنها ستنفصل في النهاية عن القارورة.
علاوة على ذلك ، لتأكيد هوية الخلايا المعزولة ، تم استخدام تلطيخ خلايا مولر المناعي لخلايا مولر علامات محددة لتأكيد العزل الناجح لخلايا مولر. تم استخدام بروتين خيوط الهيكل الخلوي الوسيط المسمىvimentin 12,13. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام سينثيتاز الجلوتامين (GS) ، الذي يحفز تفاعل تكثيف الغلوتامات والأمونيا لتشكيل الجلوتامين ، كوظيفة رئيسية لخلايا مولر الدبقية في شبكية العين ،5.
بشكل جماعي ، الخلايا المعزولة ملطخة سلبية ل RPE65 (أحمر ، الشكل 1 ب) ، موجبة للفيمنتين (أخضر ، الشكل 1 ج) و GS (أخضر ، الشكل 1 د). إذا كان التلوين يؤكد العزلة الناجحة (النقاء والنوعية) لخلايا مولر المعزولة. الشكل 1E ، هو عنصر تحكم سلبي للفيمنتين (اللوحة العلوية) و GS (اللوحة السفلية) ، مما يؤكد خصوصية الأجسام المضادة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66237/66237fig01.jpg"> الشكل 1: التحقق من عزل خلية مولر (النقاء والنوعية). (أ) صورة مجهرية ضوئية للمقاطع: المقطع صفر (P0) و (P1) مورفولوجيا. (ب) التلوين المناعي RPE65 جنبا إلى جنب مع التلوين النووي DAPI. (ج) تلطيخ فيمنتين المناعي مع تلطيخ DAPI النووي عند التكبير العالي. (د) تلطيخ منااعي GS عند التكبير العالي نفسه. (ه) ضوابط سلبية لتأكيد خصوصية تلطيخ الأجسام المضادة vimentin و GS. شريط المقياس = 300 ميكرومتر ، 300 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر ، 20 ميكرومتر ، 20 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر ، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66237/66237fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لعزل خلايا مولر الدبقية في شبكية العين عن عيون الفئران. يبدأ البروتوكول باستئصال وتشريح عيون الفأر ، يليه عزل خلايا مولر وبذرها وزراعتها.

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، سوف نقوم شرح كيفية عزل الخلايا الجذعية من الظهارة الشبكية الهدبية للعين الماوس وتنمو لهم في مجالات الثقافة لتشكيل نسيلي الشبكية. المجالات التي يتم عزل تمتلك خصائص أساسية للخلايا الجذعية : الذات وتجديد multipotentiality.

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

يوضح هذا الفيديو استزراع خلايا مولر الدبقية (MG) المعزولة من شبكية العين الفئرانية. يتم فصل شبكية العين إلى معلق أحادي الخلية باستخدام الإنزيمات الهاضمة. ثم تزرع الخلايا في وسط مع عامل نمو يعزز تكاثر خلايا MG وموت الخلايا العصبية. تتم إزالة الخلايا العصبية الميتة أثناء المرور ، وتزرع خلايا MG لمزيد من التحليل.

إنشاء مزرعة الخلايا الدبقية في مولر التي تم الحصول عليها من شبكية العين الفئرانية

يعاني الملايين من الناس من أمراض تنكسية في شبكية العين تؤدي إلى عمى لا رجعة فيه. وهناك عنصر شائع في العديد من هذه الأمراض هو فقدان خلايا العقدة الشبكية (رغس). يصف هذا البروتوكول تفصيلا عزل رغس الفئران الأولية عن طريق اختيار الإيجابية والسلبية مع التدفق الخلوي.

عزل الخلايا العقدة الشبكية الفئران الأولية (رغس) عن طريق التدفق الخلوي

ويرد بروتوكول لعزل microglia الأولية من العقول مورين. يساعد هذا الأسلوب في الفهم الحالي للظروف العصبية. يتم الجمع بين الكثافة المتدرجة الطرد المركزي والفصل المغناطيسي لإنتاج المحصول كافياً من عينة نقية جداً. وعلاوة على ذلك، فإننا مخطط الخطوات اللازمة لتوصيف microglia.

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

يصف لنا عزلة إيمونوماجنيتيك oligodendrocytes الماوس الأساسي، الذي يسمح لعزل الخلايا في المختبر الثقافة سريعة ومحددة.

عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

وهنا يصف لنا عزل الخلايا المعوية الدبقية من الأمعاء سوبموكوسا استخدام متسلسلة يدتا إينكوبيشنز يخلب الكاتيونات ديفالينت والحضانة في الخلية غير الانزيمية حل الاسترداد ثم. تصفيح تعليق الخلية الناتجة في بولي-د-يسين و laminin النتائج في ثقافة مخصب بدرجة عالية من الخلايا الدبقية سوبموكوسال للتحليل الوظيفي.

عزل الخلايا الدبقية المعوي من سوبموكوسا والصفيحة بروبريا الماوس الكبار

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في النماذج الحيوانية لأمراض إزالة الميالين ، باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا العمودي.

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية للفأر عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا في النماذج الحيوانية لإزالة الميالين

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مبسطا لعزل خلايا الظهارة المصطبغة في الشبكية (RPE) عن عيون الفئران بطريقة تدريجية. يتضمن البروتوكول استئصال وتشريح عيون الفئران ، يليه عزل خلايا RPE وبذرها وزراعتها.

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر

تمثل مزارع مولر الدبقية الأولية التي تم الحصول عليها من شبكية العين الفأرية أداة قوية وموثوقة للغاية لدراسة التحويل الدبقي إلى خلايا سلف شبكية العين بعد علاج الحمض النووي الريبي الميكروي. يمكن اختبار جزيئات أو تركيبات مفردة قبل تطبيقها اللاحق للنهج في الجسم الحي .

مزارع الخلايا الأولية لدراسة إمكانات تجديد مورين مولر غليا بعد علاج الحمض النووي الريبي الميكروي

تعمل ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) كحاجز حاسم بين المشيمية والشبكية ، مما يعزز صحة ووظيفة أنواع خلايا الشبكية ، مثل المستقبلات الضوئية. هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا وفعالا لعزل وزراعة الفئران البالغة RPE.

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لعزل خلايا مولر الشبكية الأولية من فئران Sprague-Dawley (SD) حديثي الولادة. يتضمن الإجراء استئصال مقل العيون ، وتشريح أنسجة الشبكية ، واستخراج الخلايا وتحديدها ، والاعتبارات الرئيسية لزراعة الخلايا اللاحقة.

عزل واستزراع خلايا مولر الشبكية الأولية من فئران Sprague-Dawley (SD)

تعلم عزل خلايا مولر الدبقية من شبكية الفأر باستخدام التربسين والتنمية في الوسط المناسب. تتيح هذه الطريقة دراسة أدوار هذه الخلايا في أمراض الشبكية وتطوير أهداف علاجية محتملة.

عزل خلايا مولر الدبقية الدبقية لشبكية الفأر الأولية

استكشف المزيد من الفيديوهات