عزل خلايا مولر الدبقية الدبقية لشبكية الفأر الأولية

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لعزل خلايا مولر الدبقية في شبكية العين عن عيون الفئران. يبدأ البروتوكول باستئصال وتشريح عيون الفأر ، يليه عزل خلايا مولر وبذرها وزراعتها.

خلايا مولر هي الخلايا الدبقية الرئيسية في شبكية العين. يؤدون دورا مهما للغاية للحفاظ على الخلايا العصبية النشطة للغاية في التمثيل الغذائي في شبكية العين. أنشأ مختبرنا تقنية لعزل خلايا مولر عن عيون الفئران. ستمكن هذه التقنية من دراسة دور خلايا مولر في أمراض الشبكية المختلفة ، وفهم التسبب في الأمراض ، وكذلك تطوير الأهداف العلاجية.

[الراوي] قتل الفأر أخلاقيا وفقا للطرق المعتمدة لمؤسستك. قم باستئصال العينين عن طريق الضغط على ملاقط نمط 5/45 على المنطقة المدارية للحث على داء البروبتوز ، متبوعا باستخراج العين عن طريق وضع ذراعي الملقط في الجزء الخلفي من العين ، متبوعا بالسحب برفق من المنطقة المدارية. ضع العينين في 10 مل من محلول العين الخلية مولر واتركهما يجلسان طوال الليل ، أو لمدة 18 ساعة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. بعد 18 ساعة ، قم بصب محلول العين عن طريق سكبه من الأنبوب المراد التخلص منه. اغسل العينين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات الدافئ أو PBS. صب PBS مرة أخرى عن طريق سكبه من الأنبوب المراد التخلص منه. ثم ضع العينين في طبق بتري 100 ملم يحتوي على 10 مل من محلول التربسين. ضع الطبق في حاضنة واحتضنه لمدة 1.5 إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، انقل العينين إلى طبق بتري مقاس 60 ملم يحتوي على ما يقرب من خمسة مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة. الجدير بالذكر أنه تم تسجيل الفيديو خارج غطاء المحرك لتحسين الرؤية والعرض الواضح. بالنسبة للتجارب الفعلية ، يجب إجراؤها في غطاء تدفق رقائقي كما هو موضح. ضع العينين تحت مجهر تشريح وابدأ في التشريح. استخدم ملاقط نمط M5S ومقص Vannas لإزالة النسيج الضام والعضلات خارج العين والعصب البصري. هنا ، يتم قطع العصب البصري بمقص فاناس. أمسك العين باستخدام ملاقط نمط M5S وقم بعمل شق في قسم ora serrata بمقص Vannas أو إبرة حقنة. أمسك الشق بملاقط من نمط M5S وابدأ في سحب أو تمزيق القرنية من الجزء الخلفي من العين. اسحب بزيادات صغيرة لضمان بقاء سلامة شبكية العين سليمة. فيما يلي عرض توضيحي حول كيفية إزالة القرنية من الجزء الخلفي من كوب العين. بمجرد انكشاف العدسة والشبكية العصبية ، قم بإزالة الطبقة المصطبغة من العين ، والتي من المحتمل أن تلتصق بها القزحية. ثم قم بإزالة شبكية العين العصبية من العدسة. قم بإزالة أي أنسجة مصطبغة من شبكية العين العصبية لتعزيز نقاء العزل. نظرا للطبيعة اللزجة لشبكية العين العصبية ، فمن غير المحتمل أن تزيل جميع الأنسجة المصطبغة. اجمع كل شبكية العين العصبية وقم بتمزيقها إلى قطع أصغر. ضع شبكية العين العصبية في قارورة T25 تحتوي على أربعة مللي من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة. أخيرا ، ضع القارورة في حاضنة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تظهر اللوحة أ ثقافة خلية مولر صحية عند الممر صفر والممر الأول. يشير نقص الصبغة إلى عدم وجود خلايا RPE ، وهي التلوث الأساسي في العزلة. يتم تعزيز هذا في اللوحة B باستخدام RP65 ، وهي علامة خاصة ب RP.