Name: القياس الكمي للشوكميبة spp. الحركه (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: استكشف تحليل الصور عالي المحتوى لتتبع حركة Acanthamoeba spp. باستخدام المجهر والتقنيات الحسابية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آلية الإصابة بالتهاب القرنية وتحسين ممارسات النظافة للعدسات اللاصقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>التتبع طويل الأجل والقياس الكمي لحركة أنواع الشوكميبة

<ol><li>Randag, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rising+incidence+of+Acanthamoeba+keratitis%3A+A+7-year+nationwide+survey+and+clinical+assessment+of+risk+factors+and+functional+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes.</a> PLoS One. 14 (9), e0222092(2019).</li>
<li>Szentmary, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+keratitis+-+Clinical+signs%2C+differential+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Curr+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba keratitis - Clinical signs, differential diagnosis and treatment.</a> J Curr Ophthalmol. 31 (1), 16-23 (2019).</li>
<li>Carnt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+keratitis%3A+confirmation+of+the+UK+outbreak+and+a+prospective+case-control+study+identifying+contributing+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba keratitis: confirmation of the UK outbreak and a prospective case-control study identifying contributing risk factors.</a> Br J Ophthalmol. 102 (12), 1621-1628 (2018).</li>
<li>Verani, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+outbreak+of+Acanthamoeba+keratitis+associated+with+use+of+a+contact+lens+solution%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">National outbreak of Acanthamoeba keratitis associated with use of a contact lens solution, United States.</a> Emerg Infect Dis. 15 (8), 1236-1242 (2009).</li>
<li>Tu, E. Y., Joslin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+outbreaks+of+atypical+contact+lens-related+keratitis%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Recent outbreaks of atypical contact lens-related keratitis: what have we learned.</a> Am J Ophthalmol. 150 (5), 602-608 (2010).</li>
<li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISO+14729%3A2001%2FA1.+Ophthalmic+optics-Contact+lens+care+products-Microbiological+requirements+and+test+methods+for+products+and+regimens+for+hygienic+management+of+contact+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22International+Organization+for+Standardization%22%5BJournal%5D)">ISO 14729:2001/A1. Ophthalmic optics-Contact lens care products-Microbiological requirements and test methods for products and regimens for hygienic management of contact lenses.</a> International Organization for Standardization. , Geneva, Switzerland. (2010).</li>
<li>ASC Z80, Parent Committee Meeting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf">https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf</a> (2023).</li>
<li>Rayamajhee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba%2C+an+environmental+phagocyte+enhancing+survival+and+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba, an environmental phagocyte enhancing survival and transmission of human pathogens.</a> Trends Parasitol. 38 (11), 975-990 (2022).</li>
<li>Reverey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superdiffusion+dominates+intracellular+particle+motion+in+the+supercrowded+cytoplasm+of+pathogenic+Acanthamoeba+castellanii%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Superdiffusion dominates intracellular particle motion in the supercrowded cytoplasm of pathogenic Acanthamoeba castellanii.</a> Sci Rep. 5, 11690(2015).</li>
<li>Thapa, S., Lukat, N., Selhuber-Unkel, C., Cherstvy, A. G., Metzler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+superdiffusion+of+polydisperse+vacuoles+in+highly+motile+amoeboid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Transient superdiffusion of polydisperse vacuoles in highly motile amoeboid cells.</a> J Chem Phys. 150 (14), 144901(2019).</li>
<li>Rudell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+migration+in+an+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba migration in an electric field.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (6), 4225-4233 (2013).</li>
<li>Fukaya, S., Aoki, K., Kobayashi, M., Takemura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+the+motility+of+giant+virus-infected+amoebae+using+phase-contrast+microscopic+images%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of the motility of giant virus-infected amoebae using phase-contrast microscopic images.</a> Front Microbiol. 10, 3014(2019).</li>
<li>Fukaya, S., Takemura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+Acanthamoeba+castellanii+infected+with+giant+viruses+quantitatively+revealed+process+of+morphological+and+behavioral+changes+in+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of Acanthamoeba castellanii infected with giant viruses quantitatively revealed process of morphological and behavioral changes in host cells.</a> Microbiol Spectr. 9 (1), 0036821(2021).</li>
<li>Cheng, H. J., Hsu, C. H., Hung, C. L., Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+for+cell+and+particle+tracking+on+microscopy+images+using+algorithms+and+deep+learning+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+J%22%5BJournal%5D)">A review for cell and particle tracking on microscopy images using algorithms and deep learning technologies.</a> Biomed J. 45 (3), 465-471 (2022).</li>
<li>Mathieu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+lens-free+imaging+of+cell+migration+in+diverse+physical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments.</a> Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).</li>
<li>Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+cell+tracks%3A+Quantifying+cell+migration+by+time+lapse+image+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis.</a> Cytometry A. 93 (3), 357-370 (2018).</li>
<li>Piltti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+time-lapse+imaging+and+single-cell+tracking+of+in+vitro+cultured+neural+stem+cells+-+Tools+for+analyzing+dynamics+of+cell+cycle%2C+migration%2C+and+lineage+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells - Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection.</a> Methods. 133, 81-90 (2018).</li>
<li>Campolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+real-time+motility+analysis+of+Acanthamoeba+reveals+sustained+movement+in+absence+of+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Continuous real-time motility analysis of Acanthamoeba reveals sustained movement in absence of nutrients.</a> Pathogens. 10 (8), 995(2021).</li>
<li>Campolo, A., Patterson, B., Lara, E., Shannon, P., Crary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+recovery+of+Acanthamoeba+motility+among+surviving+organisms+after+contact+lens+care+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Complete recovery of Acanthamoeba motility among surviving organisms after contact lens care disinfection.</a> Microorganisms. 11 (2), 299(2023).</li>
<li>Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+affecting+the+recovery+of+Acanthamoeba+trophozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites.</a> Pathogens. 10 (2), 221(2021).</li>
<li>imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started">https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started</a> (2024).</li>
<li>Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Gaussianity%2C+population+heterogeneity%2C+and+transient+superdiffusion+in+the+spreading+dynamics+of+amoeboid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells.</a> Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&frac14; رنجر s الحل</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BR0052G</td><td>Oxoid Ringers Solution Tablets. اتبع التعليمات لجعل قوة الربع بدلا من Ringers بكامل قوتها.</td></tr><tr><td>10 وميكرو ؛ L ماصة</td><td>Eppendorf Research</td><td>3123000039</td><td>2 & micro; L-20 وميكرو ؛ L قناة واحدة</td></tr><tr><td>10 وميكرو ؛ أطراف ماصة L</td><td>نبتون العلمي ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>BT10.N</td><td>10 & micro ؛ L طرف الحاجز العالمي</td></tr><tr><td>48 لوحة بئر</td><td>Millipore Sigma ، &nbsp ؛</td><td>CLS3548</td><td>لوحة الآبار المتعددة المعالجة ب Corning Costar TC: صفيحة البوليسترين ، آبار القاع المسطحة ، معقمة ، مع غطاء</td></tr><tr><td>50 مل أنابيب مخروطية (1 لكل عينة ، 1 لكل تمرير 2 عينة)</td> <td>فيشر ساينتفيك</td><td>فالكون 352098</td><td>فالكون 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية عالية الوضوح ، لوحة البولي بروبيلين</td></tr><tr><td>96 بئر</td><td>ميليبور سيجما ، برلنغتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>CLS3596</td><td>لوحة الآبار المتعددة المعالجة ب Corning Costar TC: صفيحة البوليسترين ، آبار القاع المسطحة ، معقمة ، مع غطاء</td></tr> <tr><td>Acanthamoeba &nbsp ؛ </td><td>American Type Culture Collection ، ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>ATCC 30461</td><td>تم التحقق من هذا البروتوكول ل ATCC 50655 ، 30872 ، 50702 ، 30010 ، 30461 ، 50370 ، 50703 ، 30137 ، PRA-115 ، و PRA-411</td></tr><tr><td>وسائط ثقافة أكسينيك (AC6)</td> <td>صنع في المنزل</td><td>غير</td> متوفر <td>يحتوي على 20 جم بيبتون حيوي ، 5 جم جلوكوز ، 0.3 جم KH2PO4 ، 10 و micro ؛ ز فيتامين ب 12 ، و 1 كوب 5 مجم & nbsp ؛ L-ميثيونين لكل لتر من الماء المقطر منزوع الأيونات. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.6-6.95 مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم والأوتوكلاف عند 121 درجة ؛ C لمدة 20 دقيقة ، يحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 3 أشهر.</td></tr><tr><td>أجهزة الطرد المركزي والدوار المناسب</td><td>Thermo Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>Sorvall ST 40R</td><td>أي جهاز طرد مركزي ودوار مكافئ مقبولان طالما أنه يمكن أن يدور 50 مل من الأنابيب المخروطية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق</td></tr><tr><td>من الانجذاب الكيميائي وأداة الهجرة برنامج</td><td></td><td></td><td>مجاني يعتمد على ImageJ ، متوفر في https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</td></tr><tr><td>مقياس كثافة</td> <td>الدم القابل للتصرفBulldog Bio ، بورتسموث ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>DHC-N01</td><td>Neubauer مقياس كثافة الدم القابل للتصرف 2 رقاقة محسن ، معبأ بشكل فردي ، برنامج ImageJ غير</td></tr> الحراري <tr><td>مع البرنامج المساعد Trackmate (هذا البروتوكول مكتوب باستخدام الإصدار 6.0.2 من Trackmate.)</td><td></td><td></td><td>البرمجيات الحرة التي طورتها المعاهد الوطنية للصحة ، وهي متاحة في imagej.net. المكون الإضافي Trackmate متاح في https://imagej.net/plugins/trackmate/</td></tr> <tr><td>المجهر ، ويفضل أن يكون ذلك مع المرحلة المتحركة الآلية</td><td>نيكون ، طوكيو ، اليابان</td><td></td><td>تم استخدام مجهر نيكون Eclipse Ti-U في هذه الدراسة وتم استخدام المرحلة المتحركة الآلية لتكون قادرة على تسجيل الصور في آبار متعددة في وقت واحد.</td></tr><tr><td>برنامج NIS-Elements</td> ماصة <td>نيكون</td><td></td><td></td></tr><tr><td>المصلية</td><td>فيشر العلمية ، هامبتون ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>BrandTech 26331 BrandTech</td><td>accu-jet pro Pipet Controller أطراف</td></tr><tr><td>ماصة مصلية</td><td>VWR</td><td>5 مل: 76201-710 10 مل: 170356 25 مل: 89130-900 50 مل: 75816-088</td><td>VWR ماصة مصلية ،</td></tr><tr><td>خلية تدفق نقل نقل معقمة من الألومنيوم غير الناري</td><td>شركة Biosurface Technologies Corporation ، Bozeman ، MT ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>FC 81-AL</td><td>خلية تدفق نقل أحادية القناة من الألومنيوم المؤكسد مع بصمة لوحة 96 بئرا للاستخدام مع مجهر مقلوب</td></tr><tr><td>T75 قوارير</td><td>VWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>734-2316</td><td>قارورة زراعة الأنسجة VWR ، 182.5 سم ، معالجة السطح ، غطاء ختم التوصيل ، معقم</td></tr></tbody></table>

القياس الكمي للشوكميبة spp. الحركه

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

لتحقيق النجاح باستخدام هذه الطريقة ، هناك العديد من القطع الشاملة الحاسمة التي يجب مراعاتها. الأول هو الإعداد المادي للأميبا والمجهر ، والثاني هو الاستخدام السليم لبرنامج التصوير ، والثالث هو تصدير وتحليل بيانات التصوير بطريقة ذات معنى.
قبل بدء التسجيل المجهري ، من الأهمية بمكان التأكد من أن الأميبا تركز بشكل صحيح على مرحلة المجهر (الشكل 1). بدلا من التركيز على الأميبا في المستوى Z الأمثل للحصول على التفاصيل الفردية ، من المثالي هنا عرضها خارج التركيز قليلا بحيث تصبح نقاطا سوداء صلبة بدلا من حالتها الشفافة عند عرضها بالتفصيل. سيسمح عرضها بهذه الطريقة لبرنامج التصوير وبرنامج التتبع بالعثور على كل أميبا فردية بسهولة أكبر عند تحويل الملف إلى ثنائي (الشكل 2). إن معرفة الهدف في برنامج التصوير - أي ظهور كل أميبا كدائرة بيضاء محددة جيدا ، قد يساعد القارئ في العثور على التركيز المناسب عند التقاط الصور الأصلية في برايتفيلد. بعد ذلك ، مع تحديد كل دائرة بوضوح ، سيكون برنامج التتبع قادرا على تتبع حركة وجمع مقاييس الحركة الفردية لكل أميبا بشكل صحيح.
بعد اتباع الإرشادات خطوة بخطوة في البروتوكول المذكور أعلاه لبرنامج التصوير وبرنامج التتبع والإشارة إلى الفيديو المرتبط للمساعدة في الخطوات الأولى الحاسمة لاستخدام برنامج التصوير ، فقد حان الوقت لتصدير بيانات برنامج التصوير للقياس الكمي وتحليل البيانات. سيكون الناتج الخام من برنامج التتبع مشابها لما هو موضح في الشكل 3. هنا ، من المهم التحقق من صحة عدد النقاط في المسارات التي تم تصديرها لما هو متوقع (على سبيل المثال ، إذا طلب المرء وجود 93٪ من الإطارات في كل مسار وكان لدى الآخر 100 إطار إجمالي في الفيديو ، فيجب أن يحتوي كل مسار تم تصديره على أكبر من أو يساوي 93 نقطة). إذا كانت البقع لا تتطابق مع المتطلبات ، فقد يحتاج المرء إلى الرجوع إلى خطوات برنامج التتبع لضمان تعيين المعلمات المطلوبة بشكل صحيح.
من التصدير الخام ، ابدأ في إنشاء ورقة تحليل البيانات (الشكل 4). من المهم أن تتذكر أن كل مسار يمثل أميبا مفردة داخل نسخة متماثلة مفردة. لذلك ، كما هو موضح في الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6 ، يجب حساب متوسط جميع المسارات لمجموعة الإطارات أو النقطة الزمنية (الشكل 4) ، ويجب إجراء هذه العملية لكل مجموعة إطارات أو نقطة زمنية في سلسلة كاملة (على سبيل المثال ، إذا تم التقاط ما مجموعه 3 ساعات من الفيديو وتم تقسيم نقاط البيانات على الساعة ، ثم سيكون هناك ثلاث مجموعات إطارات / ساعات لتحليلها لكل نسخة متماثلة ، الشكل 5). أخيرا ، من هذه المجموعة من المتوسطات في كل مجموعة إطارات في كل نسخة متماثلة ، يجب دمج البيانات المتوسطة من كل نسخة متماثلة في مساحة واحدة بحيث يمكن تحليل البيانات عبر النسخ المتماثلة المتعددة لتحديد المتوسط الحقيقي والانحراف المعياري لكل نقطة زمنية (الشكل 6).
سيتم استخدام المتوسطات من كل نسخة متماثلة لتحليل البيانات ، وسيتم استخدام المتوسط المشترك والانحراف المعياري أو الخطأ المعياري من جميع النسخ المتماثلة للتمثيل الرسومي (كما هو موضح في مثال في الشكل 7). إذا كان تحليل البيانات كما فعلنا هنا ، وهو عينات متعددة يتم اتباعها خلال نقاط زمنية متعددة ، فمن الأنسب تحليلها باستخدام مقياس تكرار 2-way ANOVA مع اختبار Tukey اللاحق. وهذا يسمح لنا بتحديد الاختلافات بين العينات في كل نقطة زمنية، وكذلك تحديد الاختلافات داخل كل عينة بمرور الوقت.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig01.jpg"> الشكل 1: تظهر الأميبا كأشكال داكنة معتمة في مجهر برايتفيلد. تم تكبير الصورة التمثيلية للأميبا بتكبير 4x ، خارج التركيز قليلا لتظهر كدوائر داكنة صلبة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig02.jpg"> الشكل 2: الأميبا المصورة في مجهر برايت فيلد تتحول إلى ثنائية وتتبع. تم تحويل الأميبا عند تكبير 4x ، في برايتفيلد (يسار) ، إلى ثنائي مع إزالة القطع الأثرية (في الوسط) ، وبعد التتبع ، مع ظهور مسارات محددة (يمين). الصف العلوي: صورة بئر كاملة عن طريق خياطة 4 صور معا ، شريط المقياس = 1000 ميكرومتر. الصف السفلي: حجم صورة واحدة قبل الخياطة ، شريط المقياس = 500 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig03.jpg"> الشكل 3: يحتوي ناتج تحليل البيانات الفوري من برنامج التصوير والتتبع على مجموعة متنوعة من أنواع البيانات. يظهر الناتج التمثيلي من التتبع في الشكل 2 ، وهو فيديو مفرد. لاحظ أرقام المسار (السهم الأحمر) تخطي الأرقام ، مما يشير إلى أن برنامج التعقب أزال المسارات التي لم تتم محاذاتها مع المعلمات بشكل صحيح. في هذا المثال، تم تحديد 71 مسارا فقط من أصل 5385 مسارا متوافقا مع المعلمات. هذه النسبة طبيعية ، بالنظر إلى هذه الإرشادات الصارمة. يتماشى هذا العدد من المسارات أيضا مع عدد الأميبا المستخدمة في هذا البروتوكول (على سبيل المثال ، إذا تم زرع صفيحة 96 بئرا ب 200 ميكرولتر من 7.5 × 103 CFU / mL لكل بئر ، فيجب على المرء أن يتوقع حوالي 1500 أميبا في البئر وتقريبا أن العديد منها مرئي في مجال رؤية مكون من 4 غرز. من المحتمل أن يكون هناك العديد من المسارات أكثر من الأميبا حيث تمشي الأميبا داخل وخارج مجال الرؤية ، مما يولد مسارات جديدة). يظهر رقم المسار هذا مرة أخرى في الشكل 2 ، حيث لا يظهر سوى عدد قليل من المسارات مقارنة بعدد كبير من المواقع. تحقق دائما من عدد النقاط في المسار (المربع الأحمر) للتأكد من تضمين أطوال المسار الصحيحة فقط. على سبيل المثال ، هنا ، نقوم بتضمين أكثر من 93٪ من الإطارات ، وكان هناك 127 إطارا في هذا القسم ، لذلك يجب أن تكون جميع أعداد النقاط أعلى من 118. تم تمييز القياسات التي تم ذكرها في البروتوكول باللون الأصفر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig04.jpg"> الشكل 4: إعادة تنظيم البيانات حسب الحاجة بعد إخراج البيانات الأولي. تنظيم البيانات المطلوبة بعد التصدير. (أ) تم نسخ القياسات ذات الصلة المختارة للقياس الكمي من تصدير برنامج التتبع (الشكل 3) ولصقها في جدول بيانات جديد. (ب) بعد تنظيم القياسات المطلوبة في جدول البيانات الجديد ، يجب حساب متوسط كل مسار. وبالتالي ، في هذا المثال التمثيلي ، تم حساب متوسط المسافة الإجمالية والمسافة القصوى والحبس ومتوسط السرعة والإزاحة لكل مسار قابل للاستخدام في هذا الفيديو المفرد إلى رقم واحد لكل قياس. لاحظ مرة أخرى هنا أن ما مجموعه 71 مسارا استوفت معايير الإطارات 1-127. من المحتمل أن يكون هناك عدد مختلف من المسارات المناسبة من كل مقطع فيديو أو مجموعة إطارات تم تحليلها ، كما هو موضح في الشكل 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig05.jpg"> الشكل 5: إطارات متسلسلة تم تعيينها لتحليل سلسلة صور أو فيديو كامل. هذه صورة تمثيلية لإضافة مقاطع فيديو متسلسلة إلى تحليل البيانات. بافتراض أن الإطارات 1-127 تشكل الساعة 1 من الفيديو (هنا ، يتكون 1 h من التقاط صورة مرة كل 28 ثانية). ستكون الإطارات 128-254 هي الساعة 2 من الفيديو ، وستكون الإطارات 255-381 هي الساعة 3 من الفيديو. اجمع البيانات المصدرة (كما تم تصديرها في الشكل 3) من جميع الساعات في ورقة واحدة للعمل معها جميعا مرة واحدة. كما هو الحال في الشكل 4 ، سيتم حساب متوسط البيانات من جميع المسارات القابلة للاستخدام لكل مجموعة إطارات / ساعة. كل شيء في الشكل 5 هو البيانات من نسخة واحدة أو عينة واحدة. إذا كان هناك 3 نسخ متماثلة ، فسيكون هناك 3 علامات تبويب منفصلة لجداول البيانات موضوعة بشكل متطابق ، وسيتم إدخال البيانات منها في علامة تبويب جديدة ، كما هو موضح في الشكل 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig06.jpg"> الشكل 6: البيانات المركبة من جميع الأميبا في كل مجموعة إطارات تستخدم لتمثيل نسخة متماثلة واحدة. (أ) يجب جمع جميع المتوسطات من كل إطار محدد في الشكل 5 في موقع مركزي حتى يمكن إكمال تحليل البيانات النهائي. في هذه الصورة التمثيلية، يتم عرض متوسطات المسافة الإجمالية من مجموعات الإطارات الثلاثة الأولى (أو الساعات). يجب تكرار ذلك لكل عينة / حالة / نسخة متماثلة يتم تشغيلها. بعد ذلك ، يجب حساب متوسط المتوسطات من كل عينة من كل مجموعة إطارات (المربع الأصفر). هذه هي نقطة البيانات النهائية التي يمكن من خلالها حساب الانحراف المعياري والخطأ المعياري. المتوسطات الفردية من كل عينة (هنا ، الأرقام في B3 و B4 و B5 لعينة المسافة الإجمالية 1 ؛ C3 و C4 و C5 لعينة المسافة الإجمالية 2 ، إلخ.) لتشغيل التحليل الإحصائي. سيتم تكرار هذه العملية لجميع القياسات المطلوبة (المسافة القصوى ، الحبس ، متوسط السرعة ، الإزاحة ، إلخ.) (ب) لعمل تمثيل بياني للقياس الكمي، استخدم الأرقام الموجودة في المربع الأصفر كنقاط بيانات لاستخدامها في التمثيل البياني النهائي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig07.jpg"> الشكل 7: بيانات الحركة الأولية ل ATCC 30461 و ATCC 50370. تم جمع البيانات الأولية (الممثلة هنا كمتوسط ± SE لكل ساعة) سابقا ولم يتم نشرها للدراسات السابقة18,19. يوضح هذا القياس الكمي للحركة أن هاتين الأميبا متشابهتان في أول 6 ساعات من الحركة (كما تم قياسها بالمسافة الإجمالية بالميكرون المقطوع في تلك الساعة) في محلول رينغر على سطح زجاجي. تمثل كل نقطة زمنية ثلاث نسخ متماثلة منفصلة ، يتكون كل منها من 20-200 مسار أميبا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential ...

quantification-of-acanthamoeba-spp-motility

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يُعد اختبار مسار الحركة البلعومية طريقة تُستخدم لتقييم حركة الخلايا. وبشكل محدد، يقيس هذا الاختبار الحركة الكيميائية (حركية الخلايا العشوائية) بمرور الوقت بطريقة كمية. ويستفيد الاختبار من قدرة الخلايا على تكوين مسار قابل للقياس لحركتها على شرائح تغطية مطلية بالذهب الغروي.

A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic

المصدر: موراليس سوتو ، ن. وآخرون ، التحضير والتصوير والقياس الكمي لمقايسات حركة السطح البكتيري. J. Vis. خبرة. (2015)يوضح هذا الفيديو مقايسة حشد باستخدام البكتيريا التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر لمراقبة حركة السطح على الأجار الناعم. يلتقط التصوير بفاصل زمني التمدد المنسق وتكوين المحلاق ، مما يسلط الضوء على حركة السطح البكتيري.

فحص الاحتشاد لتصور حركة سطح البكتيريا

يوضح هذا الفيديو فحصا لتحديد النمو داخل الخلايا للطفيليات في الضامة المشتقة من نخاع العظام (BMMs). تصاب خلايا البلاعم بالمراحل الغازية المتحركة وغير المتحركة من الليشمانيا ، والبروماتيجوت metacyclic و amastigotes ، على التوالي. تغزو الطفيليات الضامة ، وتتداخل في فجوة طفيلية وتتكاثر في الداخل. يتم قياس نمو الطفيليات داخل الخلايا باستخدام مجهر عند تلطيخ البلاعم ونواة الطفيليات بالفلورسنت.

اختبار في المختبر لتحديد نمو الطفيليات داخل الخلايا في البلاعم

تتأثر حركة الاحتشاد بالعوامل الفيزيائية والبيئية. نصف بروتوكولا وإرشادات من مرحلتين للتحايل على التحديات المرتبطة عادة بإعداد فحص السرب وجمع البيانات. يتم استخدام تقنية التصوير العياني للحصول على معلومات مفصلة عن سلوك السرب التي لا توفرها تقنيات التحليل الحالية.

التحضير والتصوير، والكمي لالسطحية الجرثومي على الحركة فحوصات

تستخدم العديد من البكتيريا الحركة التي تحركها flagella للتنقل في بيئتها واستعمار المناطق المحيطة المواتية على حد سواء بشكل فردي وجماعي. يتضح هنا هو استخدام ثلاث طرق راسخة تستغل الحركة كأداة اختيار لتحديد المكونات / المسارات المساهمة في السباحة والحركة.

التحقيق في حركية Flagella يحركها في الإشريكية القولونية من خلال تطبيق ثلاث تقنيات راسخة في سلسلة

يصف هذا البروتوكول اثنين من المقايسات الحساسة للتمييز بين خفيفة, معتدلة, وضعف الحركة الشديدة في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري, مع فائدة عامة لسلالات C. elegans , مع تغيير الحركة.

تقييم ضعف المحرك في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري

هنا ، نصف استخدام لوحات التدرج المحفزة لتقييم حركة الاحتشاد البكتيري مع الحصول في نفس الوقت على استجابات تركيز متعددة.

قياس حركة احتشاد السطح البكتيري على ألواح التدرج المحفزة

يتراكم الكينيسين-5 Cin8 الانقسامي ثنائي الاتجاه في مجموعات تنقسم وتندمج أثناء حركتها. التراكم في مجموعات يغير أيضا سرعة واتجاه Cin8. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاختبارات الحركة مع Cin8-GFP المنقى وتحليل الخصائص المتحركة للجزيئات المفردة ومجموعات Cin8.

حركية الجزيئات المفردة ومجموعات الكينيسين-5 Cin8 ثنائية الاتجاه المنقاة من خلايا S. cerevisiae

يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج مذنبات الأكتين على أسطح الخرز باستخدام مكونات البروتين المتاحة تجاريا. تحاكي هذه الأنظمة الهياكل البارزة الموجودة في الخلايا ، ويمكن استخدامها لفحص الآليات الفسيولوجية لإنتاج القوة بطريقة مبسطة.

إعادة تكوين الحركة القائمة على الأكتين مع البروتينات المتاحة تجاريا

يقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة وفعالة لتحديد العوامل الوراثية المشاركة في أنواع مختلفة من الحركيات في الزائفة الزنجارية.

طريقة عالية الإنتاجية لمراقبة الأنماط الظاهرية الحركية في Pseudomonas aeruginosa

استكشف تحليل الصور عالي المحتوى لتتبع حركة Acanthamoeba spp. باستخدام المجهر والتقنيات الحسابية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آلية الإصابة بالتهاب القرنية وتحسين ممارسات النظافة للعدسات اللاصقة.

القياس الكمي للشوكميبة spp. الحركه

استكشف المزيد من الفيديوهات