قياس التعلم الترابطي في الانجذاب الكيميائي للديدان الخيطية Caenorhabditis elegans

أحد أكثر الأسئلة إثارة في علم الأعصاب هو كيف تنشأ ذاكرة التعلم من مرونة الخلايا العصبية. كل من المرونة والتعلم تتدهور مع التقدم في العمر. لكن من غير الواضح إلى حد كبير لماذا نحقق في الآليات المسؤولة عن هذا التراجع.

باستخدام نماذج الديدان الخيطية في التهاب العصب العظيم. لقد أصبح واضحا أن كل سلوك تقريبا لدى C.elegans يعتمد على السياق والتجربة، وأنهم يشتركون في آليات التعلم الترابطي وغير الترابطي مع كائنات أخرى. كما أن العوامل الرئيسية لتعلم C.elegans مثل النشاط العصبي وإشارات الإنسولين مرتبطة أيضا بتنظيم عمليات الحكة في الدماغ وحتى الكائن الحي بأكمله.

تستخدم التكنولوجيا الأساسية في دراسة التاكسي الكيميائي الذي يقسم أطباق بتري كما هو الحال عبر المجاهر. نستخدم أيضا كاميرات مزودة ببرامج تتبع وغرف سلوكية مصممة خصيصا لتتبع المسار وتصوير الكالسيوم باستخدام ميكروفلويدكس لتصوير الآليات الفسيولوجية وراء السلوكيات التي نلاحظها على طبق بيتري. حاليا، تجرى اختبارات تصنيف C.elegans على ألواح تدرج أو صفائح ربعية.

قد تكون صفائح التدرج صعبة الأداء لأن التدرج يتغير مع مرور الوقت، والصفائح الرباعية استخدمت فقط لمقارنة تركيزين مختلفين من الملح. لهذا السبب قدمنا استخدام الألواح البيضاء لهذا الاختبار. نريد أن نفهم لماذا تتراجع القدرة على التعلم، التي تعتمد على اللدونة العصبية، مع التقدم في العمر.

نهدف إلى استخدام اختبار التاكسي الكيميائي لاختبار ما إذا كانت مسارات الإشارة المحددة مسؤولة عن هذا الانخفاض. وبناء على ذلك، نهدف إلى تطوير علاجات تستهدف هذا التدهور المعرفي المرتبط بالعمر. لبدء نمو الدودة الخيطية، يتم تغذية صفائح الحفر المتوسطة بالإشريكية القولونية الحية OP 50.

أضف Caenorhabditis elegans N 2 على الطبق وحافظ على الحرارة طوال الليل عند 20 درجة مئوية مقلوبة لتقليل فقدان الرطوبة. في اليوم التالي، انقل 30 من الديدان الخيطية الصغيرة إلى صفيحة نمو الديدان الخيطية. دع تضع البيض لمدة تقارب ثماني ساعات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية.

بعد وضع البيض بتوقيت، قم بإزالة جميع الديدان البالغة من الطبق. قم بزراعة الطبق مقلوبا على حرارة 20 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. للاختبار، قم ببذور نصف دفعة مجموعات الألواح المريحة المطلوبة بسعة 200 ميكرولتر من OP 50 لكل طبق.

اترك الأطباق المزروعة بالبذور تجف طوال الليل عند درجة حرارة 20 درجة مئوية في الحاضنة بجانب الأطباق غير المزروعة. حضر التركيز المطلوب من محلول كلوريد الصوديوم لتر واحد في زجاجة زجاجية. استخدم المعقم على الزجاجات لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 121 درجة مئوية.

ثم دع الزجاجات تبرد لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 55 درجة مئوية في حمام ماء. في الوقت نفسه، ضع علامة على أسفل قسم شجرة YP بتركيز كلوريد الصوديوم المقابل، وارسم دائرة نصف قطرها خمسة مليمترات حول مركز الصوح حيث تلتقي الجدران. ضع كل زجاجة واحدة تلو الأخرى على محرك مغناطيسي مسخن.

أضف 25 ملليتر من محلول فوسفات البوتاسيوم الضرس الواحد عند درجة حموضة ستة لكل زجاجة. اخلط جيدا لمدة دقيقتين. ثم أضف كوليسترول الكالسيوم وكلوريد الكالسيوم وكبريتات المغنيسيوم بشكل متتابع أثناء التحريك.

بعد ذلك، قم بتقسيم وسط الملي مولر الصفري إلى حجرة واحدة من طبق Y Petri حتى يصل إلى أعلى الجدار الداخلي. ودع الوسط يتصلب لمدة تقارب خمس دقائق. أليكوت وسط 100 ملم مول في الحجرة الثانية من طبق Y Petri حتى يلمس المقطع الصفري المجاور لها.

ثم استخدم رأس ماصة معقم بسعة 10 ميكرولتر لكسر التوتر السطحي على طول الجدار الصودي وربطه بقسم كلوريد الصوديوم ذو الصفر مليمول. دع الوسط يتجمد لمدة خمس دقائق. أليكوت الوسط ذو 50 ميلي مول في الحجرة المتبقية من طبق Y Petri حتى يصل إلى الأقسام المتصلبة صفر مليمولر و100 مليمول.

ثم استخدم رأس ماصة معقمة بسعة 10 ميكرولتر لكسر التوتر السطحي على طول جدار Y وربط قسم كلوريد الصوديوم بحجم 50 ملم مول بالقسمين الآخرين. بعد ترك الوسط ليتصلب لمدة خمس دقائق، خزن الصحون طوال الليل عند درجة حرارة 20 درجة مئوية. لبدء استخدام ماصة ملليلتر واحد من محلول M 9 المعقم على صفيحة نمو تحتوي على Caenorhabditis elegans.

حرك اللوحة بلطف لإزاحة الديدان من العشب البكتيري OP 50 والمثقاب لتشكيل تعليق. قم بإمالة اللوح لجمع تعليق الدودة في مخزن M 9 باستخدام رأس ماصة بلاستيكية بسعة ملليلتر واحد مع قطع الجزء العلوي. انقل نظام التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليتر.

دع الديدان تستقر في قاع أنابيب الطرد المركزي الدقيق لمدة تقارب 60 ثانية لتشكيل الحبيبة. ثم أزل المادة الفائقة باستخدام ماصة بسعة ملليلتر واحد دون الإزعاج بالحبيبة. اغسل الحبيبة بملليلتر واحد من محلول M 9 المعقم مرتين.

لإزالة بقايا OP 50. يعلق ريس الحبيبة في 300 ميكرولتر من مخزن M 9. بعد الغسل الأخير.

قم بتدوير التعليق لتوزيع الديدان بشكل متساو وانقل ببطء 50 ميكرولتر من تعليق الديدان الذي يحتوي على حوالي 200 إلى 300 دودة إلى كل صفيحة تكييف. بالنسبة للأطباق المزروعة بمحلول Op 50، ضع قطرة الدودة بعيدا عن عشب الطعام البكتيري وادعها تمتص في الثقب. حافظ على الألواح مقلوبة في الحاضنة عند 20 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

بعد التكييف، قم بعمل ماصة واحدة من محلول M 9 المعقم على لوحة تكييف وحركها بلطف لإزاحة الديدان المكونة من تعليق. ثم قم بإمالة اللوح لجمع تعليق الدودة باستخدام رأس ماصة بلاستيكية بحجم ملليتر واحد ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليتر. خلال 60 ثانية، تستقر الديدان وتشكل حبيبة.

بعد إزالة السوبرناتانت، اغسل الديدان مرتين باستخدام ملليلتر واحد من محلول M 9 المعقم. ثم املأ أنبوب الطرد المركزي الدقيق بمخزن M 9 حتى علامة ملليلتر واحدة. بمجرد تكوين الحبيبة الدودية، أزل 960 ميكرولتر من المادة الفائقة دون إزعاج الحبيبة.

الآن قم بتدوير أو هز الأنبوب بلطف لإعادة تعليق الديدان. نقل 20 ميكرولتر من هذا التعليق الذي يحتوي على حوالي 100 إلى 150 دودة إلى مركز لوحة الفحص حيث تلتقي مقاطع الجدار Y. دع الديدان تتجول لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية.

ثم عد عدد الديدان في كل قسم من لوحة الفحص وعدها مرة أخرى بعد 30 دقيقة. احسب مؤشر كيموتاكسيس لكل لوحة لكل نقطة زمنية باستخدام الصيغة المحددة. تأثرت سلوكيات Caenorhabditis elegans البرية بشكل كبير بالتكييف لمدة أربع ساعات على أطباق تحتوي على مستويات مختلفة من كلوريد الصوديوم مع الطعام أو بدونه.

بعد 30 دقيقة على لوحة الفحص، أظهرت الديدان التي تم تهيؤها بتركيزات عالية من كلوريد الصوديوم والطعام، وكذلك تلك التي لم تحتوي على كلوريد الصوديوم ولا طعام مؤشر إيجابي للتأثير الكيميائي مما يشير إلى تفضيل تركيزات أعلى من كلوريد الصوديوم. وعلى العكس، أظهرت الديدان المتوافقة مع تركيزات عالية من كلوريد الصوديوم وعدم وجود طعام، وتركيزات متوسطة من كلوريد الصوديوم، وعدم وجود طعام وبدون كلوريد الصوديوم مع الطعام، مؤشر التاكسي الكيميائي السلبي مما يشير إلى تفضيل تركيزات أقل لكلوريد الصوديوم. استمرت جمعية طعام كلوريد الصوديوم بعد 60 دقيقة مع مؤشر الكيموتاكسي، وغالبا ما تتغير في الديدان المكيفة بالطعام مما يشير إلى التعلم الترابطي الديناميكي مع تحديث لهذا الارتباط أثناء التجول والبحث عن الطعام.