سير عمل للتقييم الكمي للميكروبيومات البكتيرية الداخلية والنباتية لحاء Populus trichocarpa

[مقدم العرض] سير عمل للتقييم الكمي للميكروبيوم البكتيري الباطن والمعرفي لحاء Populus trichocarpa. قمنا هنا بتصميم واختبار سير عمل مفصل لدراسة الميكروبيوم الذي يستعمر الأنسجة الداخلية أو أسطح لحاء Populus trichocarpa. يصف سير العمل هذا بالتفصيل أخذ عينات من الميكروبيومات الداخلية والظهارية لحاء Populus trichocarpa ، ومعالجة المواد التي تم جمعها ، واستخراج الحمض النووي الجيني ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للمناطق المستهدفة ، وإعداد مكتبات الحمض النووي وتسلسل الميكروبيوم البكتيري الداخلي والمعرفي عبر تقنية تسلسل الجيل التالي. كما نقدم إجراء تحليليا موجزا لبيانات التسلسل التي تم الحصول عليها. سيوفر سير العمل المثبت هذا نهجا فعالا للتحقيق تجريبيا في مجتمعات الميكروبيوم الداخلية والمعرفية لحاء Populus trichocarpa وأنواع الغابات الأخرى. قم بزراعة شتلات Populus trichocarpa البالغة من العمر ثلاثة أشهر في غرفة النمو ، وقم بقطع الأجزاء الجذعية التي يبلغ طولها 10 سم من Populus trichocarpa من سنتيمترين إلى 12 سم فوق سطح التربة المعقمة باستخدام مقص معقم. ضع شرائح الساق في طبق بتري مربع معقم. امسح بشرة الساق بشكل متكرر على طبق بتري المربع المعقم باستخدام قطن معقم بنسبة 0.1٪. توين 20. قم بتخزين كل قطعة من القطن تحتوي على كائنات دقيقة وعينات إيبثية في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مليلتر عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد مسح سطح الجذع ، افتح اللحاء بمشرط معقم ، وقشر اللحاء وضعه في طبق بتري مربع. قطع اللحاء الذي تم تجريده من الجذع إلى أجزاء سنتيمتر واحد تقريبا بمشرط معقم. تعقيم أسطح المقطع عن طريق نقع 70٪ كحول لمدة دقيقتين ، ثم نقع الأجزاء في هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 0.1٪ ، Tween 80 لمدة خمس دقائق. أخيرا ، قم بتعقيم الأجزاء في 70٪ كحول لمدة 30 ثانية. ثم اغسل جميع العينات ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم وضعها على مقعد نظيف لتجفيف الهواء. قم بتخزين كل عينات من النباتات الداخلية لحاء الساق المعقمة في أنبوب طرد مركزي معقم سعة ملليلترين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. ضع أقسام لحاء الساق في أنابيب صلبة معقمة سعة خمسة ملليلتر وأضف ثلاث حبات فولاذية معقمة في كل أنبوب. قم بتجميد الأنابيب الصلبة التي تحتوي على العينات في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق. سحق عينات اللحاء لمدة خمس دقائق باستخدام مضرب الخرز. ثم قم بتجميد الأنبوب الصلب مرة أخرى في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة وكرر خطوة ضرب الخرزة لمدة خمس دقائق. أضف لحاء الجذع المسحوق من Populus trichocarpa والمجتمعات البكتيرية الظهارية الملتصقة بالقطن ، 0.25 جرام لكل منهما ، إلى كل أنبوب من أنابيب الخرزة ثم أضف 60 ميكرولترا من المحلول C1 الذي توفره مجموعة تجارية ، وخلطها برفق عن طريق الانعكاس. بعد ذلك ، قم بتجانس العينات الداخلية والمعرفية باستخدام مضرب حبة في أربع جولات دقيقة واحدة. بعد كل تشغيل ، ضع العينات على الجليد لمدة 30 ثانية. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 10,000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقة واحدة ، واستخرج العينات الداخلية والظهارية باستخدام مجموعة باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، وأضف 30 ميكرولترا من المحلول C6 إلى مركز غشاء المرشح الأبيض واحتضانه عند 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. جهاز طرد مركزي عند 10,000 مرة من الجاذبية في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. قياس تركيزات الحمض النووي الجيني المستخرج من العينات الظهارية والنبتة الداخلية باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم. قم بتخفيف كل عينة من الحمض النووي باستخدام ddH2O المعقم إلى نانوغرامين لكل ميكرولتر للحصول على قالب الحمض النووي لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتضخيم منطقة V5 إلى V7 من جين rRNA البكتيري 16S باستخدام التمهيدي الأمامي 799F والبرايمر العكسي 1193R. وفي الوقت نفسه ، قم بتضخيم منطقة V4 من جين rRNA البكتيري 16S باستخدام التمهيدي الأمامي 5115F والبرايمر العكسي 806R. امزج كل عينة جيدا وجهاز الطرد المركزي للتخلص من الفقاعات. قم بتضخيم منطقة V5 إلى V7 أو V4 لجينات الرنا الريبية البكتيرية 16S على جهاز تدوير حراري. قم بتحميل خمسة ميكرولتر من كل عينة Amplicon على هلام Agarose 1٪ وقم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 120 فولت لمدة 30 دقيقة. اعرض الجل تحت مصابيح الأشعة فوق البنفسجية للتحقق من تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل بنجاح. لكل عينة ، امزج ثلاث نسخ مكررة من منتجات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنبوب PCR. حدد تركيز المنتجات المضخمة باستخدام مجموعة تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بقياس التألق باستخدام قارئ الألواح الدقيقة. ارسم منحنى الحمض النووي القياسي واستخدمه لحساب تركيزات الحمض النووي للمنتجات المضخمة. وفقا لتركيزها المقاس ، قم بخلط منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تم الحصول عليها من عينات النباتات الداخلية أو المشاشية من لحاء Populus trichocarpa بتركيز متساو لبناء مكتبة Amplicon. إجراء الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز باستخدام جهاز الرحلان الكهربائي. قم بإعداد جل أغاروز 1.3٪ لفترة وجيزة ، و 1.3 جرام من مسحوق الاغاروز في 100 مل من محلول TAE مرة واحدة. قم بإزالة الأمشاط بعد تصلب الهلام وضع الجل في خزان الرحلان الكهربائي مع عازلة TAE مرة واحدة. بعد ذلك ، أضف وحدة حجم واحدة من المخزن المؤقت للتحميل البرتقالي ستة أضعاف إلى خمس وحدات حجم لكل منتج PCR مع 100 ميكرولتر من السلم المحمل في كل بئر. أضف 30 ميكرولترا من سلم الحمض النووي إلى بئر واحد. بعد توصيل الأسلاك الموجبة والسالبة ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي 80 فولت لمدة 50 دقيقة. استئصال شظايا الحمض النووي من هلام الاغاروز باستخدام مشرط نظيف وحاد. قم بوزن شريحة الجل وانقلها إلى أنبوب عديم اللون. أضف عازلة لغمر شريحة الجل. قم بإجراء استخراج الجل باستخدام مجموعة استخراج الجل باتباع تعليمات الشركة المصنعة. حدد تركيز مكتبة Amplicon المنقاة على مقياس الفلور باستخدام مجموعة تجارية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة للتنميط المتسلسل. اقرأ أنابيب الفحص القياسية والعينة باستخدام مقياس الفلور وتأكد من جودة المكتبة من خلال تصور نطاق واحد. قم بتحليل تسلسل الجينات 16S rRNA والتعليق عليها باستخدام CHAM II. قم بعمل تعليقات توضيحية تصنيفية باستخدام قاعدة البيانات الفضية وفقا للتسلسلات المرجعية. تصور هذه النتائج باستخدام حزمة ggplot2 في R. تم الحصول على الحمض النووي الجيني عالي الجودة للميكروبيوم البكتيري الداخلي والمعرفي لحاء Populus trichocarpa. أسفر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لجميع العينات ال 12 عن نطاقات قوية مفردة بالحجم الصحيح. تم بناء مكتبة Amplicon بشكل أكبر بذروة واحدة استوفت متطلبات التسلسل المسبق. بالنسبة للميكروبيومات الداخلية ، تم الحصول على قراءات عالية الجودة باستخدام أزواج التمهيدي 799F / 1193R و 515F / 806R على التوالي. أسفر زوج التمهيدي 799F / 1193R عن عدد أقل بكثير من قراءات النباتات المضخمة. كان عدد ASVs من الميكروبيوم المعرفي لحاء Populus trichocarpa أعلى بكثير عند استخدام 799F / 1193R مقارنة بالبادئات 515F / 806R. قدر مؤشر شانون بأنه أقل في المجتمع البكتيري المشاشي لللحاء منه في المجتمع البكتيري الداخلي باستخدام زوج التمهيدي 799F / 1193R. تم استكشاف الخصائص التصنيفية للمجتمعات البكتيرية في أجزاء اللحاء الداخلية والنباتية من Populus trichocarpa باستخدام زوج التمهيدي 799F / 1193R. تم بناء سير عمل موثوق وفعال من جمع العينات إلى تحليل البيانات لتحديد تكوين وتنوع الميكروبيوم البكتيري الداخلي والمعرفي لحاء Populus trichocarpa. قد يكون بروتوكولنا بمثابة مسار لدراسة ميكروبيوم اللحاء لأنواع النباتات الخشبية ، مما يسمح بفهم أفضل لخصائص المجتمعات البكتيرية التي تعيش في النباتات الخشبية الأخرى.