التصوير المجهري للقوة الذرية عالي السرعة للتجميع الذاتي لحمض النووي ثلاثي النقاط باستخدام التنصت على الرنين الحراري الضوئي

في مختبرنا ، نقوم بتطوير تقنيات قياس جديدة لبيولوجيا النانوية. نركز بشكل خاص على تطوير الفحص المجهري عالي السرعة للقوة الذرية لدراسة العمليات البيولوجية الديناميكية على مقياس النانومتر. ولهذا ، قمنا مؤخرا بتطوير وضع تصوير جديد ، والذي نسميه التنصت على الرنين الحراري الضوئي ، أو PORT.

في هذا الوضع ، نستخدم ليزر محرك مخصص لتشغيل الكابولي الذي يتم التحكم فيه بسرعة عالية ، مما يتيح لنا الحصول على البيانات وما يصل إلى أمرين من حيث الحجم أسرع من التنصت التقليدي خارج الرنين. المعيار الذهبي في AFM عالي السرعة هو التصوير في وضع الرنين. في هذا الوضع ، يتم تشغيل الكابولي عند تردد الرنين هذا ، مما يعني أنه لا يمكن التحكم في موضع الكابولي ، فقط سعة التذبذب.

بالنسبة للسرعة العادية AFM ، أصبحت أوضاع الرنين خارج الرنين شائعة بشكل متزايد. ومع ذلك ، فإن تردد التشغيل محدود هنا ، مما يجعل أوضاع التصوير هذه بطيئة للغاية. باستخدام ليزر ثانوي لتشغيل الكابولي ، يمكننا تحقيق ترددات تشغيل أعلى ، مما يعني سرعات تصوير أعلى.

يسمح لنا هذا النهج بالحفاظ على المزايا المرتبطة بأوضاع التوظيف الأخرى غير الرنين ، مما يعني أنه يمكننا تحسين التوازن بين حساسية التصوير والسرعة. نحن مقيدون في سرعة التصوير بأعلى صورة شخصية. إذا أردنا زيادة الصورة ، فنحن بحاجة إلى زيادة قوة الليزر من أجل الحفاظ على نفس سعة التشغيل.

هذا يمكن أن يؤدي إلى ضعف التحكم في القوة وتلف العينة. إن تحسين عرض النطاق الترددي للناتئ عن طريق تقليل حجمها وتحسين كفاءة امتصاص الليزر سيمكننا من تحقيق معدلات منفذ أعلى مع ضمان تخليص العينة الكافي. سيسهل هذا التقدم معدلات تصوير أسرع وهو أمر بالغ الأهمية لفحص تعقيدات ديناميكيات التجميع.

للبدء ، قم بتنظيف وإعداد الكاتانيلفر. قم بتركيب الكابولي على حامل متوافق مع المجهر الإلكتروني الماسح أو نظام SEM. ثم قم بتسخين غاز السليفة لاستخدامه في نظام حقن الغاز لزراعة الطرف الجديد.

بمجرد أن يصل الفراغ إلى أقل من 10 إلى قوة سالب خمسة مللي بار ، قم بتطهير خط حقن الغاز 10 مرات لمدة ثانيتين لكل منهما لإزالة أي هواء متبقي من خط الفوهة. استخدم SEM لتحديد نهاية الكابولي. قم بإمالة الحامل بزاوية لمحاذاة الكابول بشكل صحيح للتصوير المجهري للقوة الذرية.

اضبط موضع وتركيز محرك البحث للحصول على رؤية واضحة لطرف الكابولي حيث سيتم زراعة طرف نانو الكربون. بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات الترسيب في البرنامج لتنمية الطرف الجديد. ابدأ عملية الترسيب لتنمية الطرف بإشعاع شعاع الإلكترون على طرف الكابولي أثناء حقن غاز السلائف وإيقاف حقن الغاز بمجرد اكتمال الترسيب.

قم بإجراء تصوير ما بعد النمو SEM لتقييم جودة وخصائص الطرف المزروع حديثا ، بما في ذلك نصف قطره وطوله. قم بإزالة الحامل من غرفة SEM. للبدء ، قم بإعداد مجهر القوة الذرية عالي السرعة.

استخدم الملقط لوضع ناتئ قصير جدا أسفل مشبك الزنبرك على حامل الكابول. باستخدام حقنة ، أضف 50 ميكرولترا من السائل من خلال منفذ الوصول إلى السوائل الأيسر. ثم استخدم ثلاثة مقابض على رأس AFM لمحاذاة ليزر القراءة على الكابولي.

راقب ظل الكابولي على ورقة بيضاء مع تعظيم المجموع. ثم قم بتوسيط بقعة الليزر على الصمام الثنائي للصور باستخدام المقابض المخصصة. بعد ذلك ، حدد المربع الممكن للإثارة في الإثارة VI لتشغيل ليزر القيادة ومحاذاته ، وتشغيل الكابولي وتذبذبه.

اعرض إشارات الإثارة والانحراف الكابولية على راسم الذبذبات. استخدم طريقة الظل وقم بزيادة سعة التذبذب إلى أقصى حد باستخدام مقابض ضبط ليزر القيادة. لضبط سعة التذبذب الكابولي في المنفذ ، أضف جهد تيار مستمر إلى دائرة التحكم في الصمام الثنائي بالليزر في صندوق التكوين في الإثارة السادسة وأدخل إدخال مدخلات التيار المتردد من الذروة إلى الذروة لدائرة التحكم في الصمام الثنائي بالليزر.

للحصول على منحنيات التفاعل، اضبط وحدة التحكم Z VI على وضع الاتصال وانقر فوق ابدأ للاقتراب من سطح العينة. بمجرد الوصول إلى السطح ، قم بإجراء منحنى القوة مقابل المسافة في المنحدر السادس لمعايرة حساسية انحراف الكابولي. انقر فوق سحب لسحب Z piezo من السطح حيث لا يمكن أن يصل الطرف.

بعد التراجع الكامل ، قم بالتبديل إلى وضع المنفذ في وحدة التحكم Z VI وقم بتشغيل ليزر الإثارة في الإثارة VI.اضبط وضع المنفذ على التردد المطلوب. تم الحصول على منحنيات تفاعل واضحة عن طريق طرح التذبذب الحر من تذبذب التلامس ، وهو أمر بالغ الأهمية لتصوير العينة الحيوية غير المدمرة. بمعدل منفذ 100 كيلو هرتز ، تم تحقيق جودة تصوير جيدة.

ومع ذلك ، مع اقتراب تردد الإثارة من الرنين الكابولي ، تدهور التحكم في التغذية الراجعة ، مما أدى إلى منحنيات تفاعل محجوبة وتدهور جودة الصورة. للبدء ، قم بإعداد محلول 10 مللي مولار من أسيتات المغنيسيوم. باستخدام حقنة هاميلتون ، قم بحقن 50 ميكرولترا من المحلول في القناة السائلة لحامل الكابولي ، مما ينتج عنه قطرة من السائل تحيط بالناتئ.

اضبط حجم المسح الضوئي في المسح السادس على 800 × 800 نانومتر ومعدل الخط على 100 هرتز. لمسح السطح ضوئيا، انقر فوق سهم الإطار للتحقق من الجودة. بعد المسح الضوئي ، انقر فوق سحب في وحدة التحكم Z VI لسحب الكابولي من السطح.

باستخدام حقنة هاميلتون ، قم بإزالة محلول المخزن المؤقت من حامل الكابول. ثم قم بإعداد محلول نجمي ثلاثي النقاط مخفف من الحمض النووي وحقن 50 ميكرولترا من هذا المحلول في حامل الكابول. قم بإجراء التصوير بمساحة 800 × 800 نانومتر بمعدل خط افتراضي يبلغ 100 هرتز.

بعد الفحص الأولي، اضبط حجم التصوير وسرعته وامسح VI ضوئيا إلى القيم المحددة لمزيد من الحصول على البيانات احتفظ بإدخال نقطة الضبط في مربع نقطة ضبط وحدة التحكم Z VI عند أدنى مستوى ضروري للتتبع الدقيق طوال عملية التصوير. كرر هذا لجميع مناطق العينة المطلوبة. باستخدام هذا البروتوكول ، لوحظ التجميع في الوقت الفعلي لأشكال الحمض النووي ثلاثية النقاط في جزر مستقرة بواسطة منفذ AFM عالي السرعة.

تم الحصول على صور واضحة بمعدلات خط 100 و 200 هرتز بمعدل منفذ 100 كيلو هرتز. ومع ذلك ، فإن سرعات التصوير الأعلى دون زيادة معدلات المنافذ قللت من جودة الصورة بسبب التغييرات السريعة في التضاريس. أظهرت نتائج التصوير لنجم الحمض النووي ثلاثي النقاط لأدنى مدخلات تيار متردد من الذروة إلى الذروة هياكل سليمة بينما أدى أعلى إدخال تيار متردد من الذروة إلى تلف العينة بشكل ملحوظ بسبب القوى الأعلى.

وبالمثل ، كشف أدنى إدخال إزاحة للتيار المستمر عن هياكل سليمة بينما تسبب أعلى إدخال إزاحة للتيار المستمر في أضرار هيكلية.