Name: تحضير عينات الشبكية للفحص المجهري الإلكتروني الحجمي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 48 s
Description: تعلم تحضير عينات الشبكية للمجهر الإلكتروني الحجمي باستخدام تقنية FIB-SEM لدراسة البنى ثلاثية الأبعاد لمحطات المستقبلات الضوئية في فئران المختبر. يوفر هذا البروتوكول صورًا عالية الدقة للأغشية الخلوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>تصور الهياكل المشبكية للشبكية في 3D باستخدام المجهر الإلكتروني الحجمي

<ol><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+in+molecular+structural+biology%3A+A+historical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey.</a> Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).</li>
<li>Varsano, N., Wolf, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+cellular+ultrastructure+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions.</a> Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).</li>
<li>Briggman, K. L., Bock, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+electron+microscopy+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structure and function of ribbon synapses.</a> Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).</li>
<li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).</li>
<li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+at+rod+and+cone+ribbon+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina.</a> Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).</li>
<li>Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+at+ribbon+synapses+in+the+retina+and+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea.</a> Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).</li>
<li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+synaptic+ribbons%3A+how+they+are+built+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).</li>
<li>Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+immunoprecipitated+synaptic+ribbons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Prot+Res%22%5BJournal%5D)">Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons.</a> J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).</li>
<li>Zampighi, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conical+tomography+of+a+ribbon+synapse%3A+structural+evidence+for+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion.</a> PLoS One. 6 (3), e16944(2011).</li>
<li>Barnes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+diversity+of+the+rod+spherule%3A+A+study+of+serially+reconstructed+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs.</a> Plos One. 11 (3), e0150024(2016).</li>
<li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, e25916(2017).</li>
<li>Crewe, A. V., Lin, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+backscattered+electrons+for+imaging+purposes+in+a+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope.</a> Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).</li>
<li>Richards, R. G., Gwynn, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Backscattered+electron+imaging+of+the+undersurface+of+resin-embedded+cells+by+field-emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy.</a> J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).</li>
<li>Wergin, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+thin+and+thick+sections+of+biological+tissue+with+the+secondary+electron+detector+in+a+field-emission+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope.</a> Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).</li>
<li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+%28OTO%29+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).</li>
<li>Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+of+specimen+preparation+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy.</a> Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity in the retina.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).</li>
<li>Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+EM+reconstruction+of+spinal+cord+reveals+wiring+specificity+in+speed-related+motor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits.</a> Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).</li>
<li>Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+electron+microscopy+and+neural+microcircuit+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis.</a> Front Neural Circuits. 12, 98(2018).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+approach+using+cryofixation+for+high-resolution+3D+analysis+by+FIB-SEM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM.</a> J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).</li>
<li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+staining+method+%28OTO%29+for+enhancing+contrast+of+lipid-containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide-fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide+%28TCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH).</a> J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2،2،2-Tribromoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>علم المجهر الإلكتروني</td><td>الأسيتون</td><td>10000</td><td></td></tr><tr><td>Amira 6.8</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td> <td>Sigma</td><td>C-2661</td><td></td></tr><tr><td>تضمين القالب</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology</td><td>GP10590</td><td></td></tr><tr><td>Epon علم المجهر الإلكتروني الراتنج</td><td></td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول</td><td>سيجما</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>علم المجهر</td><td>الإلكتروني الجلوتارالديهايد</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>Helios NanoLab 600i ثنائي الشعاع SEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>حمض الأسبارتيك L-Aspartic</td><td>Sigma</td><td>56-84-8</td><td></td></tr><tr><td>نترات الرصاص</td><td>Sigma</td><td>10099-74-8</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>مكون من مخزن الفوسفات</td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>مكون من عازلة الفوسفات</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>TED PELLA</td><td>4008-160501</td><td></td></tr><tr><td>علم المجهر الإلكتروني</td><td>بارافورمالدهايد</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>فيروسيانيد البوتاسيوم</td><td>سيجما</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>كاكوديلات الصوديوم</td><td>سيجما</td><td>6131-99-3</td><td></td></tr><tr><td>مغطي الرش</td><td>Leica</td><td>ACE200</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>Sigma</td><td>2231-57-4</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات اليورانيل</td><td>تيد</td><td>بيلا CA96049</td><td></td></tr></tbody></table>

تحضير عينات الشبكية للفحص المجهري الإلكتروني الحجمي

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

يوضح الشكل 1 أ صورة محطات المستقبلات الضوئية للشبكية المحضرة باستخدام طريقة التثبيت المزدوج الكيميائي التقليدية ، ويوضح الشكل 1 ب صورة محطات المستقبلات الضوئية للشبكية المحضرة باستخدام طريقة OTO. تم أخذ عينات من كلاهما بواسطة FIB-SEM. يمكن ملاحظة أنه يمكن الاحتفاظ ببنية غشاء الخلية قدر الإمكان باستخدام طريقة OTO ، وحتى الخطوط العريضة للحويصلات يمكن رؤيتها بوضوح. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تباين الصور التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة OTO أكثر وضوحا أيضا.
يوضح الشكل 2 سير العمل التجريبي المستخدم لإعادة بناء خصائص البنية التحتية لمحطات المستقبلات الضوئية. ركزت إعادة الإعمار على أربعة أنواع من أطراف المستقبلات الضوئية ، بما في ذلك عنيق M-cone ، والعنيق S-cone ، وكرات rod1 ، وكرات rod2. كان التركيز الرئيسي على المكونات الأساسية ، مثل الميتوكوندريا ، والشرائط المشبكية ، وبرك الحويصلة المشبكية داخل أطراف المستقبلات الضوئية.
يعرض الشكل 3 الميتوكوندريا المعاد بناؤها والأشرطة المشبكية في أطراف المستقبلات الضوئية للقضيب. والجدير بالذكر أن الأشرطة المشبكية لكروات rod2 تظهر شكل حدوة حصان مميز ، وعادة ما يتميز بشريط واحد لكل كروة. علاوة على ذلك ، يسلط الشكل 2 الضوء على وجود اثنين من الميتوكوندريا في كرات القضيب ، مع وضع ثابت داخل المساحة المركزية للأطراف ، الموجودة فوق الأشرطة المتشابكة. تم تتبع جميع الهياكل يدويا ، صفحة تلو الأخرى.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig01.jpg"> الشكل 1: أمثلة على الصور التي تم أخذ عينات منها باستخدام FIB-SEM لطريقة التثبيت المزدوج الكيميائي التقليدية وطريقة OTO. (أ) طريقة التثبيت المزدوج الكيميائي التقليدية. (ب) طريقة OTO. شريط المقياس: 1000 نانومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig02.jpg"> الشكل 2: سير عمل إعادة بناء ثلاثي الأبعاد لمطاريف المستقبلات الضوئية باستخدام FIB-SEM. بعد المحاذاة باستخدام برنامج تصور البيانات ثلاثية الأبعاد ، تم تقسيم الصور التسلسلية يدويا وعرضها لمزيد من التحليل. (أ) الصور التسلسلية الأصلية. (ب) الصور المحاذاة. (ج) الصور المجزأة. (د) الصور المعاد بناؤها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig03.jpg"> الشكل 3: إعادة بناء 3D. تصور صور إعادة البناء ثلاثية الأبعاد التمثيلية محطات مستقبلات ضوئية باللون الأبيض ، والميتوكوندريا باللون البرتقالي ، وشرائط متشابكة باللون الأزرق. شريط المقياس: 500 نانومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

preparation-of-retinal-samples-for-volume-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

البروتوكول الموصوف هنا مخصص للتقييم الهيكلي لإعداد الشبكية الكاملة. يتضمن ذلك أوصافا لتشريح الأنسجة ، والتركيب على غشاء متعدد تترافلورو إيثيلين مجفف بالماء (PTFE) ، وتحميل البلعة بعلامات الفلورسنت ، ومقارنة التثبيت مع الكربوديميد وبارافورمالديهايد للتحليل الكيميائي المناعي للمكونات الخلوية والمشبكية.

بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية

التصوير نسيج الشبكية يمكن أن توفر معلومات الخلايا المفردة التي لا يمكن جمعها من الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. ويصف هذا البروتوكول إعداد الشرائح الشبكية من الزرد لتصوير [كنفوكل]. فلوري وراثيا ترميز أجهزة الاستشعار أو الأصباغ مؤشر يسمح التصور للعديد من العمليات البيولوجية في أنواع مختلفة من الخلايا الشبكية.

إعداد شرائح الشبكية الطازجة من الزرد الكبار السابقين فيفو التصوير تجارب

علينا أن نظهر ثلاث تقنيات إعداد الأنسجة المختلفة للتصور المناعي للفئران بيريسيتيس microvascular الشبكية و أي البرد-أقسام والجامع--يتصاعد والعزلة ناقص التوتر لشبكة الأوعية الدموية.

البرد الشبكية-الفروع، الجامع--يتصاعد، والتحضيرات ناقص التوتر المفرج معزولة للتصور المناعي من بيريسيتيس ميكروفاسكولار

هنا ، نقدم طريقة للتحقيق في مورفوجينيا العصب في شبكية العين بعد الولادة بواسطة المجهر البؤري بفاصل زمني. نحن نصف نهجا لوضع العلامات المتناثرة واكتساب أنواع خلايا الشبكية وعملياتها الدقيقة باستخدام ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدية المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء بطريقة تعتمد على Cre.

التصوير بالفاصل الزمني للتشجير العصبي باستخدام وضع العلامات على الفيروسات المرتبطة بالأدينو المتناثرة لمجموعات خلايا الشبكية المستهدفة وراثيا

يقدم هذا البروتوكول تقنيتين لعزل المقصورات تحت الخلوية للمستقبلات الضوئية لقضيب الفئران لتحليل البروتين. تستخدم الطريقة الأولى الشبكية الحية وورق ترشيح السليلوز لفصل الأجزاء الخارجية للقضيب ، بينما تستخدم الطريقة الثانية شبكية العين المجففة بالتجميد والشريط اللاصق لتقشير طبقات القضبان الداخلية والخارجية.

طريقتان للتقشير لعزل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين للفأر لتحليل البروتين

نحن نصف طريقة لفصل ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) بكفاءة عن شبكية العين في عيون الإنسان وتوليد حوامل مسطحة RPE / المشيمية كاملة للتحليلات النسيجية والمورفومترية ل RPE.

توليد فعال ومتسق لظهارة صبغية شبكية العين / المشيمية من العين البشرية للتحليل النسيجي

يقدم هذا العمل إعدادا بديلا لشبكية العين المسطحة حيث تتيح إزالة أجسام الخلايا المستقبلة للضوء انتشارا أسرع للأجسام المضادة وتحسين وصول ماصة التصحيح إلى الخلايا العصبية الداخلية للشبكية للكيمياء المناعية والتهجين في الموقع وتجارب الفيزيولوجيا الكهربية.

انقسام الشبكية كتحضير مسطح محسن لدراسة الخلايا العصبية للطبقة النووية الداخلية في شبكية الفقاريات

يحدد هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية للفحص المجهري الإلكتروني المناعي قبل التضمين ، مع التركيز على استكشاف الدوائر المشبكية وتوطين البروتين في شبكية العين.

فحص دوائر الشبكية والتوطين الجزيئي عن طريق التضمين المسبق للمجهر الإلكتروني المناعي

يوفر هذا البروتوكول إجراء تحضيرا محسنا ومتقنا لعينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ. وهي مناسبة للتطبيقات التي تنطوي على تحليل نقاط الاشتباك العصبي في عضويات الشبكية الناضجة.

تحضير عينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ

تم فحص الخلايا المحيطة في الأوعية الدموية الشبكية عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي باستخدام مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية β بعد الحقن المداري الرجعي ليكتين الطماطم الفلوري. تمت معالجة شبكية العين المسماة بطريقة تطهير الأنسجة وتم تركيبها بالكامل لتصور المناظر ثلاثية الأبعاد للخلايا المحيطة بالأوعية الدموية الشبكية تحت مجهر متحد البؤر.

تصور ثلاثي الأبعاد للخلايا الوعائية الشبكية في الفئران عن طريق التلوين المناعي 

تعلم تحضير عينات الشبكية للمجهر الإلكتروني الحجمي باستخدام تقنية FIB-SEM لدراسة البنى ثلاثية الأبعاد لمحطات المستقبلات الضوئية في فئران المختبر. يوفر هذا البروتوكول صورًا عالية الدقة للأغشية الخلوية.

تحضير عينات الشبكية للفحص المجهري الإلكتروني الحجمي

استكشف المزيد من الفيديوهات