Name: بناء شبكات التمثيل الغذائي خارج التوازن في حويصلات بحجم النانو والميكرومتر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: اكتشف بروتوكول بناء شبكات التمثيل الغذائي خارج التوازن في حويصلات بحجم النانو والميكرومتر. يُمكّن هذا الأسلوب من إنشاء خلايا اصطناعية قادرة على النمو المستقل وتطبيقات في التشخيص والعلاج.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يشكر المؤلفون Aditya Iyer على استنساخ جين pBAD-PercevalHR و Gea Schuurman-Wolters للمساعدة في إنتاج البروتين وتنقيته. تم تمويل البحث من قبل برنامج NWO Gravitation "بناء خلية اصطناعية" (BaSyC).

بروتوكول تغليف حويصلة الدهون لشبكات البروتين المعقدة

<ol><li>Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+bottom-up+assembly+of+molecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems.</a> Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).</li>
<li>Ivanov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+synthesis+of+artificial+cells%3A+recent+highlights+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges.</a> Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).</li>
<li>Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industrial+biomanufacturing%3A+The+future+of+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Industrial biomanufacturing: The future of chemical production.</a> Science. 355 (6320), (2017).</li>
<li>Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+synthetic+biology+platform+for+emerging+industrial+biomanufacturing%3A+Bottom-up+pathway+design%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Syst+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design.</a> Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).</li>
<li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-target+and+glucose-responsive+polymersomes+toward+mimicking+endogenous+insulin+secretion+with+improved+hepatic+glucose+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization.</a> Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168(2020).</li>
<li>Kanter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+production+of+scFv+fusion+proteins%3A+an+efficient+approach+for+personalized+lymphoma+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines.</a> Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).</li>
<li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology and personalized medicine.</a> Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).</li>
<li>Schwille, P., Frohn, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+protein+functions+and+what+they+may+teach+us%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hidden protein functions and what they may teach us.</a> Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).</li>
<li>Sachsenmeier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industry+5.0-The+relevance+and+implications+of+bionics+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology.</a> Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).</li>
<li>Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).</li>
<li>Godoy-Hernandez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+stable+membrane+reconstitution+by+LAiR+enables+the+study+of+physiological+integral+membrane+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions.</a> ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).</li>
<li>Sikkema, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+by+ionic+strength+and+safety+check+by+cyclic-di-AMP+in+the+ABC+transporter+OpuA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA.</a> Sci Adv. 6 (47), 7697(2020).</li>
<li>Foucaud, C., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactose+transport+system+of+Streptococcus+thermophilus.+Functional+reconstitution+of+the+protein+and+characterization+of+the+kinetic+mechanism+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport.</a> J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).</li>
<li>Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+on+solubilization+and+lipid+reconstitution+of+Na%2CK-ATPase%3A+enzyme+kinetic+and+biophysical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization.</a> Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).</li>
<li>Simidjiev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+large%2C+ordered+lamellae+from+non-bilayer+lipids+and+integral+membrane+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).</li>
<li>Harris, N. J., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+and+stability+of+membrane+transport+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Folding and stability of membrane transport proteins in vitro.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).</li>
<li>Jackson, M. L., Litman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-egg+phosphatidylcholine+reconstitution+by+an+octyl+glucoside+dilution+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).</li>
<li>Szoka, F., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+preparation+of+liposomes+with+large+internal+aqueous+space+and+high+capture+by+reverse-phase+evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation.</a> Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).</li>
<li>Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1">https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1</a> (2023).</li>
<li>Lee, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+artificial+organelles+sustain+and+control+ATP-dependent+reactions+in+a+protocellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system.</a> Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).</li>
<li>Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%A9l%C3%A9ard%2C+P+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. , Elsevier. 161-176 (2009).</li>
<li>Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+transmembrane+protein%2C+the+voltage-gated+ion+channel%2C+KvAP%2C+into+giant+unilamellar+vesicles+for+microscopy+and+patch+clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies.</a> J. Vis. Exp. (95), e52281(2015).</li>
<li>Doeven, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li>
<li>Pols, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+metabolic+network+for+physicochemical+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis.</a> Nat Commun. 10 (1), 4239(2019).</li>
<li>Bailoni, E., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+recycling+fuels+sustainable+glycerol+3-phosphate+formation+in+synthetic+cells+fed+by+dynamic+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis.</a> ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).</li>
<li>Van Der Heide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+osmotic+signal+and+osmosensing+mechanism+of+an+ABC+transport+system+for+glycine+betaine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine.</a> EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).</li>
<li>Van'T Klooster, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipid+requirements+of+the+lysine+transporter+Lyp1+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae.</a> J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).</li>
<li>Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microfluidic-based+approach+to+formulate+size-tuneable+large+unilamellar+cationic+liposomes%3A+Formulation%2C+cellular+uptake+and+biodistribution+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).</li>
<li>Weiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+bottom-up+assembly+of+mechanically+stabilized+synthetic+cells+by+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics.</a> Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).</li>
<li>Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymology+of+the+pathway+for+ATP+production+by+arginine+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown.</a> FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).</li>
<li>Yandrapalli, N., Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+capacity+microfluidic+trapping+of+giant+vesicles+for+high-throughput+membrane+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies.</a> Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).</li>
<li>Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459">http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459</a> (2019).</li>
<li>Elias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+characterization+of+biomimetic+membrane+mechanics+with+an+on-chip+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+Nano+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette.</a> Micro Nano Eng. 8, 100064(2020).</li>
<li>Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+trapping+of+giant+unilamellar+vesicles+to+study+transport+through+a+membrane+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore.</a> Biomicrofluidics. 7 (4), 044105(2013).</li>
<li>Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+Pressure+Enables+High-Yield+Assembly+of+Giant+Vesicles+in+Solutions+of+Physiological+Ionic+Strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths.</a> Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).</li>
<li>Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4 (1), 2550(2013).</li>
<li>Setyawati, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+dynamically+interacting+integral+membrane+subunits+of+energy-coupling+factor+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters.</a> eLife. 9, e64389(2020).</li>
<li>Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+coffee+ring+effect+for+a+defect-free+electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles.</a> Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).</li>
<li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+liposomes+from+spin-coated+films+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).</li>
</ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصلحة مالية متنافسة.

نقدم بروتوكولا لتخليق البروتين (الغشائي) الذي يحتوي على حويصلات دهنية بحجم أقل من ميكرومتر (proteoLUVs) ، وتحويل البروتينات LUVs إلى حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (proteoGUVs). يجب أن يكون البروتوكول قابلا للتطبيق لإعادة تكوين البروتينات الغشائية الأخرى13،19،30،40 وتغليف الشبكات الأيضية بخلاف انهيار L-arginine ومسارات تخليق الجلسرين 3-phosphate المعروضة هنا.
تؤدي إعادة تكوين البروتينات الغشائية في الجسيمات الشحمية عموما إلى اتجاه عشوائي للبروتينات داخل الغشاء الدهني. بالنسبة إلى ArcD و Glbt ، لا يهم الاتجاه ، لأن البروتينات تعمل في اتجاهين وتتحرك المواد المذابة اعتمادا على علامة الجهد الكهروكيميائي الكلي. بالنسبة للبروتينات التي تعمل في اتجاه واحد ، لن يكون نصف الجزيئات متاحا للنشاط عندما يكون اتجاهها 50/50.
يؤدي قذف الحويصلات من خلال مرشح البولي كربونات إلى تضييق توزيع الحجم ، وتصبح الحويصلات أكثر تجانسا كلما كان حجم مسام المرشحات أصغر. ومع ذلك ، تأتي الحويصلات الأصغر بسعر وجود حجم أصغر ، وبالتالي ، عدد صغير جدا من البروتينات (الإنزيمات ، بروتينات الغشاء) لكل حويصلة. لتقليل جزء LUVs الذي يحتوي على مكون واحد أو أكثر مفقود ، يمكن تعديل تركيز البروتينات كما هو موضح في الشكل 3A ، B ولكن مع وجود حويصلات صغيرة جدا ، لا يمكن تجنب التأثيرات العشوائية.
تعتمد طريقة التورم بمساعدة الهلام على ترسب الحويصلات الصوتية (SUVs) على سطح الأغاروز المجفف. أثناء عملية التجفيف ، يتم تشكيل تدرج تركيز الحويصلات ويكون تركيز الدهون هو الأعلى في محيط البقعة. ويرجع ذلك إلى ظاهرة تعرف باسم تأثير صبغة القهوة41,42. نتيجة لذلك ، تحتوي منطقة صغيرة فقط داخل البقعة على تركيز من الدهون المناسبة لتشكيل GUV. تؤدي البقع الدهنية الدائرية غير المركزة إلى مناطق كبيرة غير مستخدمة غير متوفرة لاندماج الحويصلات. وبالتالي ، تصبح كفاءة تشكيل GUV منخفضة في هذا النهج. لزيادة إنتاجية GUVs ، يجب على المرء أن يهدف إلى ترسب الدهون بشكل موحد ، والذي يمكن تحقيقه عن طريق طلاء الدوران42 أو الاستفادة من تأثير صبغة القهوة41.
ملاحظات أخرى على البروتوكول:
يجب الحرص على إعادة تكوين العديد من البروتينات الغشائية (>10) في المتوسط لكل حويصلة لتجنب التأثيرات العشوائية. وبالتالي ، تجنب نسب الدهون إلى البروتين أعلى من 400: 1 وزن / وزن. يفترض وجود اتجاه عشوائي لمعظم البروتينات.
من الناحية المثالية ، يكون حجم البروتينات الغشائية الكلية صغيرا قدر الإمكان ولا يتجاوز على أي حال 10-20٪ من حجم الجسيمات الشحمية. ستؤدي إضافة كميات أكبر إلى إدخال المزيد من المنظفات وقد تتحلل غالبية الجسيمات الشحمية المشكلة مسبقا ، مما قد يكون له تأثير سلبي على كفاءة إعادة التكوين.
يعد التوازن المسبق للطارد مع المحلول المناسب أمرا مهما لتجنب تخفيف المكونات أثناء التغليف. من الناحية المثالية ، يجب أن يحتوي محلول الموازنة المسبقة أيضا على الإنزيمات القابلة للذوبان ، ولكن تضمين الإنزيمات يمكن أن يكون مكلفا للغاية بسبب الحجم الكبير نسبيا اللازم للتوازن المسبق للطارد. لذلك ، نحذف عادة هذه المكونات ونقبل تخفيف الإنزيمات بنسبة 5٪.
يجب إضافة الأيونات إلى المخاليط التي تحتوي على البروتيليبوزومات لأن الجزيئات كارهة للماء بدرجة عالية وقد تمتز إلى الأسطح إذا لم تكن الحويصلات موجودة. يجب الحرص على أن يكون حجم المذيب المضاف منخفضا (<1٪ من إجمالي حجم التفاعل). يتم إجراء الضوابط للتحقق من أن المذيبات لا تؤثر على شبكات التمثيل الغذائي في الحويصلات. تركيزات الأيونوفور من حوالي 1 ميكرومتر آمنة بشكل عام لتركيزات الدهون الكلية ~ 3 ملغ / مل.
يجب توخي الحذر لتجفيف القطرات جيدا. إذا لم تكن القطرات جافة بدرجة كافية ، يكون تكوين GUV أقل كفاءة لأن الدهون ستشكل مجاميع دهنية وقد تتشكل MLVs عند إضافة محلول التورم.
يستخدم الجلوكوز لمطابقة الأسمولية الخارجية للوسط الداخلي. يحتوي الأخير على السكروز بدلا من الجلوكوز لزيادة كثافة الحويصلات وبالتالي تسهيل ترسيب GUVs. علاوة على ذلك ، فإن الجلوكوز في البيئة الخارجية يعزز تباين الطور ، مما يجعل الحويصلة أكثر سهولة.
التأثيرات العشوائية أقل بكثير من مشكلة GUVs. ولكن هنا ، يمكن أن تصبح نسبة السطح إلى الحجم منخفضة بشكل غير مقبول بحيث يصبح عدد البروتينات الغشائية (على سبيل المثال ، الناقلات) مقيدا لشبكة التمثيل الغذائي الداخلية. لا تسمح الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول بالتحكم الدقيق في حجم البروتينات GUVs ولكن الغالبية تقع في نطاق حجم 5-50 ميكرومتر.
في الختام ، يقدم العمل المقدم هنا نظرة عامة شاملة على إعادة تكوين البروتين الغشائي وتغليف الإنزيم في حويصلات دهنية بأحجام مختلفة. نوضح بناء حويصلات وظيفية لتوليف ATP واللبنات الأساسية من السلائف البسيطة مثل الأحماض الأمينية والجلسرين. لا تزال إعادة تكوين البروتينات الغشائية في GUVs تمثل تحديا ، لكن البروتوكولات المقدمة هنا تمهد الطريق لمزيد من التطورات في أبحاث البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى.

يركز مجال البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى على بناء الخلايا (الحد الأدنى) 1,2 والمفاعلات الحيوية الأيضية للتكنولوجيا الحيوية 3,4 أو الأغراض الطبية الحيوية 5,6,7,8. يوفر بناء الخلايا الاصطناعية منصة فريدة تسمح للباحثين بدراسة البروتينات (الغشائية) في ظروف محددة جيدا تحاكي تلك الموجودة في البيئات الأصلية ، مما يتيح اكتشاف الخصائص الناشئة والوظائف الكيميائية الحيوية المخفية للبروتينات وشبكات التفاعل9. كخطوة وسيطة نحو خلية اصطناعية تعمل بشكل مستقل ، يتم تطوير وحدات تلتقط السمات الأساسية للخلايا الحية مثل الحفاظ على الطاقة الأيضية ، وتخليق البروتين والدهون ، والتوازن. هذه الوحدات لا تعزز فهمنا للحياة فحسب ، بل لها أيضا تطبيقات محتملة في مجالات الطب8 والتكنولوجيا الحيوية10.
تقع البروتينات عبر الغشاء في قلب أي شبكة أيضية تقريبا لأنها تنقل الجزيئات داخل الخلية أو خارجها ، وتشير ، وتستجيب لجودة البيئة ، وتلعب العديد من أدوار التخليق الحيوي. وبالتالي ، فإن هندسة الوحدات الأيضية في الخلايا الاصطناعية تتطلب في معظم الحالات إعادة تكوين بروتينات الغشاء المتكاملة و / أو المحيطية في طبقة ثنائية غشائية تتكون من دهون محددة وسلامة عالية (نفاذية منخفضة). يمثل التعامل مع هذه البروتينات الغشائية تحديا ويتطلب معرفة محددة ومهارات تجريبية.
تم تطوير عدة طرق لإعادة تكوين البروتينات الغشائية داخل حويصلات الفوسفوليبيد ، غالبا بهدف دراسة الوظيفة11،12 ، والتنظيم13 ، والخصائص الحركية14،15 ، والاعتماد على الدهون15،16 ، و / أو الاستقرار17 لبروتين معين. تتضمن هذه الطرق التخفيف السريع للبروتين القابل للذوبان في المنظفات في وسط مائي في وجود الدهون18 ، وإزالة المنظفات عن طريق احتضان البروتين القابل للذوبان في المنظفات مع حويصلات دهنية غير مستقرة المنظفات وامتصاص المنظف (المنظفات) على حبات البوليسترين19 ، أو إزالة المنظفات عن طريق غسيل الكلى أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم20. تم استخدام المذيبات العضوية لتشكيل حويصلات دهنية ، على سبيل المثال ، عن طريق تكوين الأطوار البينية بين الزيتوالماء 21 ، ولكن غالبية البروتينات الغشائية المتكاملة يتم تعطيلها عند تعرضها لهذه المذيبات.
في مختبرنا ، نقوم في الغالب بإعادة تكوين البروتينات الغشائية بطريقة امتصاص المنظفات لتشكيل حويصلات كبيرة أحادية الصفيحة (LUVs) 19. تسمح هذه الطريقة بإعادة التكوين المشترك لبروتينات غشائية متعددة وتغليف في تجويف الحويصلة للإنزيمات والمستقلبات والمجسات22,23. يمكن تحويل LUVs المحتوية على البروتين الغشائي إلى حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) مع / بدون تغليف المكونات القابلة للذوبان في الماء ، إما باستخدام التكوين الكهربائي24 أو التورم بمساعدة الهلام25 وظروف محددة للحفاظ على سلامة بروتينات الغشاء26.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإعادة تكوين شبكة التمثيل الغذائي خارج التوازن في LUVs التي تجدد ATP من خلال انهيار L-arginine إلى L-ornithine27. يقترن تكوين ATP بإنتاج الجلسرين -3 فوسفات (G3P) ، وهو لبنة بناء مهمة لتخليق الفوسفوليبيد22,28. يتكون المسار الأيضي من بروتينين غشائيين متكاملين ، أرجينين / أورنيثين (ArcD) ومضاد G3P / Pi (GlpT). بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى ثلاثة إنزيمات قابلة للذوبان (ArcA ، ArcB ، ArcC) لإعادة تدوير ATP ، ويستخدم GlpK لتحويل الجلسرين إلى جلسرين 3-فوسفات ، باستخدام ATP من انهيار L-arginine ، انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة تخطيطية للمسار. يمثل هذا البروتوكول نقطة انطلاق جيدة للبناء المستقبلي لشبكات تفاعل أكثر تعقيدا - لتخليق الدهون أو البروتينات أو تقسيم الخلايا. يدعم التركيب الدهني للحويصلات نشاط مجموعة واسعة من البروتينات الغشائية المتكاملة وقد تم تحسينه لنقل جزيئات متنوعة داخل أو خارج الحويصلات27،29،30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة على مسار إنتاج الأدينوسين الثلاثي الفوسفات وتخليق وإفراز الجليسرول 3-فوسفات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
باختصار ، تضاف بروتينات الغشاء المنقى (القابلة للذوبان في دوديسيل β-د-مالتوسيد ، DDM) إلى حويصلات الدهون المشكلة مسبقا والتي تم زعزعة استقرارها باستخدام Triton X-100 ، مما يسمح بإدخال البروتينات في الغشاء. تتم إزالة جزيئات المنظفات لاحقا (ببطء) عن طريق إضافة حبات البوليسترين المنشط ، مما يؤدي إلى تكوين بروتيليبوزومات محكمة الغلق. يمكن بعد ذلك إضافة المكونات القابلة للذوبان إلى الحويصلات وتغليفها عبر دورات التجميد والذوبان ، والتي تحبس الجزيئات في عملية اندماج الغشاء. الحويصلات التي تم الحصول عليها غير متجانسة للغاية والعديد منها متعدد الصفائح. ثم يتم بثقها من خلال مرشح من البولي كربونات بحجم مسام 400 أو 200 أو 100 نانومتر ، مما ينتج عنه حويصلات ذات حجم أكثر اتساقا ؛ كلما كان حجم المسام أصغر ، كانت الحويصلات أكثر تجانسا وأحادية الصفيحة ولكن بسعر حجم داخلي أصغر. تتم إزالة البروتينات غير المدمجة والجزيئات الصغيرة من المحلول الخارجي عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يمكن تحويل البروتيوLUVs إلى حويصلات بحجم ميكرومتر عن طريق التورم بمساعدة الهلام ، ثم يتم جمع هذه البروتيو GUVs واحتجازها في رقاقة الموائع الدقيقة للتوصيف المجهري والمعالجة. يوضح الشكل 2 نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول الكامل.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg"> الشكل 2: نظرة عامة على بروتوكول إعادة تكوين البروتينات الغشائية وتغليف الإنزيمات والمكونات القابلة للذوبان في الماء في الحويصلات الدهنية ذات الميكرومتر الفرعي (LUVs) وحجم الميكرومتر (GUVs). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
تعمل بروتوكولات إعادة التكوين والتغليف بشكل جيد ويتم الاحتفاظ بوظائف البروتينات ، لكن البروتيوLUVs و proteoGUVs غير متجانسة في الحجم. تسمح مناهج الموائع الدقيقة31,32 بتكوين حويصلات بحجم ميكرومتر تكون أكثر تجانسا في الحجم ، لكن إعادة التكوين الوظيفي لبروتينات الغشاء غير ممكنة بشكل عام لأن المذيب المتبقي في الطبقة الثنائية يعطل البروتينات. يتراوح حجم البروتيوLUVs من 100 إلى 400 نانومتر ، وعند تركيزات منخفضة من الإنزيمات ، قد يؤدي التغليف إلى حويصلات ذات مسارات أيضية غير مكتملة (التأثيرات العشوائية ؛ انظر الشكل 3). تعد LUVs مثالية لبناء وحدات أيضية محددة ، كما هو موضح هنا لإنتاج ATP وكتل البناء مثل G3P. يمكن تغليف هذه البروتيوLUVs في GUVs وتعمل كمقصورات تشبه العضيات للحويصلات المضيفة.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg"> الشكل 3: عدد الجزيئات لكل حويصلة قطرها 100 أو 200 أو 400 نانومتر. أ: عندما تكون البروتينات المغلفة (الإنزيمات، المجسات) في نطاق 1-10 ميكرومتر. (ب) تتم إعادة التكوين عند 1 إلى 1000 ، ومن 1 إلى 10000 ، ومن 1 إلى 10000 ، ومن 1 إلى 100000 بروتين غشائي لكل ليبيد (مول / مول). نفترض أن الجزيئات مغلفة بالتركيزات المشار إليها ومدمجة في الغشاء بنسب البروتين إلى الدهون هذه. بالنسبة لبعض الإنزيمات، رأينا أنها ترتبط بالأغشية، وهو ما قد يزيد من تركيزها الظاهري في الحويصلات. اختصار: LPR = نسبة البروتين الدهني <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>مرشح قطع Amicon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Milipore وحدات مرشح الطرد المركزي Amicon Ultra & nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl 3</td> <td>ماكرون للكيماويات الدقيقة</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - الجلوكوز</td><td>Formedium-D</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(+) - السكروز</td><td>Formedium-DDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Glycon</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي إيثيل الأثير</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>276855-100 مل</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>أفانتي</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Formedium&nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>مقياس الفلور</td><td>جاسكو</td><td>مقياس الطيف الفلوري FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>عمود تدفق الجاذبية</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>حقنة هاميلتون 100 & micro ؛ L</td><td>هاميلتون</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>حقنة هاميلتون 1000 & مايكرو; L</td><td>هاميلتون</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>موزع LCP محمول</td><td>باليد Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Hielscher Tele Ultrasound Technology</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>سوبيلكو</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>كيلو كلورتون</td><td>بوم</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>كيلو < ساب >2< / فرعي > PO4</td> <td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>كيمwipe</td><td>كيميتيك ساينس</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي ذو أنبوب صقر كبير</td> جهاز طرد مركزي <td>إيبندورف</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>المجهر الضوئي</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornithine</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي</td><td>بالليزر Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>رقاقة ميكروفلويديك</td><td>محلية الصنع&nbsp;</td>DOI <td>المستند إلى PDMS</td><td>: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>مطياف Nanodrop</td><td>Isogen Life Science</td><td>ND-1000 مقياس الطيف الضوئي NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>إبر لمركبات GUV</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 جم × 3/4 بوصة 0.4 × 20 مم</td></tr><tr><td>إبر للموائع الدقيقة</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 جم × 1 1/2 بوصة 1.2 × 40 مم</td></tr><tr><td>Ni2 + Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>مقياس</td> <td>الأسموليةGonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 مقياس التناضح</td><td></td>الأساسي لنقطة التجمد</tr><tr><td>Plasmacleaner</td><td>Plasma Etch</td><td>PE-Avenger</td><td></td></tr><tr><td>مرشح البولي كربونات</td><td>Cytiva Whatman</td><td>Nuclepor Track-Etch غشاء المنتج: 10417104</td><td>0.4 & م</td></tr><tr><td>أنبوب الطرد المركزي الفائق من البولي كربونات</td><td>بيكمان كولتر</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>البيرانين</td><td>أكروس أورجانكس</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>كوفيت كوارتز (أسود)</td><td>هيلما تحليلات</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75 راتنج &nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics Sonics & amp المواد INC</td><td>Sonics vibra cell</td><td></td></tr><tr><td>phyringe filter</td><td>Sarstedt</td><td>Filtropur S plus 0.2</td><td>0.2 & micro ; م</td></tr><tr><td>مضخة حقنة</td><td>هارفارد جهاز</td><td>A-42467</td><td></td></tr> أجهزة <tr><td>الطرد المركزي المنضدية</td><td>Eppendorf</td><td>الطرد المركزي 5418</td><td></td></tr><tr><td>فاصل تفلون</td><td>Homemade&nbsp;</td><td>التفلون القائم</td><td>على 45 × 26 × 1.5 أو 45 × 26 × 3 أو 20 × 20 × 3 مم</td></tr><tr><td>تريس</td><td>بانريك AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 مل</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي</td><td>فائق Beckman Coulter</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td>مصباح الأشعة فوق البنفسجية</td><td>Spectroline</td><td>ENB-280C / FE</td><td></td></tr><tr><td>UV / VIS مطياف</td><td>جاسكو</td><td>V730 مقياس الطيف</td> الضوئي<td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>مجهر مضان واسع النطاق</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr> <tr><td>& beta ؛ - الكازين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

بناء شبكات التمثيل الغذائي خارج التوازن في حويصلات بحجم النانو والميكرومتر

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

نقدم طريقة لدمج شبكات البروتين المعقدة في الحويصلات ، والتي تتضمن بروتينات غشائية متكاملة ، وإنزيمات ، وأجهزة استشعار قائمة على التألق ، باستخدام مكونات منقاة. هذه الطريقة مناسبة لتصميم وبناء المفاعلات الحيوية ودراسة شبكات التفاعل الأيضي المعقدة خارج التوازن. نبدأ بإعادة تكوين بروتينات غشائية (متعددة) إلى حويصلات كبيرة أحادية الصفيحة (LUVs) وفقا لبروتوكول تم تطويره مسبقا. ثم نقوم بتغليف خليط من الإنزيمات المنقاة والمستقلبات وأجهزة الاستشعار القائمة على التألق (البروتينات أو الأصباغ الفلورية) عن طريق التجميد والذوبان والبثق وإزالة المكونات غير المدمجة عن طريق الطرد المركزي و / أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يتم قياس أداء الشبكات الأيضية في الوقت الفعلي من خلال مراقبة نسبة ATP / ADP أو تركيز المستقلب أو الأس الهيدروجيني الداخلي أو المعلمات الأخرى عن طريق قراءات مضان. يمكن تحويل حويصلاتنا الغشائية المحتوية على البروتين بقطر 100-400 نانومتر إلى حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) ، باستخدام الإجراءات الحالية ولكن المحسنة. يتيح هذا النهج إدراج المكونات القابلة للذوبان (الإنزيمات والمستقلبات وأجهزة الاستشعار) في حويصلات بحجم ميكرومتر ، وبالتالي زيادة حجم المفاعلات الحيوية بأوامر من حيث الحجم. يتم احتجاز الشبكة الأيضية التي تحتوي على GUVs في أجهزة الموائع الدقيقة لتحليلها بواسطة المجهر الضوئي.

تتطلب إعادة تكوين البروتينات الغشائية القابلة للذوبان في الجسيمات الشحمية زعزعة استقرار الحويصلات المشكلة مسبقا. تؤدي إضافة كميات منخفضة من Triton X-100 في البداية إلى زيادة الامتصاص عند 540 نانومتر (A540) بسبب زيادة تشتت الضوء بسبب تورم الحويصلات (الشكل 4). الحد الأقصى لقيمةA 540 هو النقطة التي يتم فيها تشبع الجسيمات الشحمية بالمنظفات (Rsat) ، وبعد ذلك ستؤدي أي إضافة أخرى ل Triton X-100 إلى ذوبان جزئي للحويصلات. في Rsol ، يتم إذابة الجسيمات الشحمية تماما (الشكل 4). لإعادة تكوين البروتينات الغشائية ، نستخدم عادة الحويصلات غير المستقرة إلى 60٪ بعد Rsat (المشار إليها بالسهم).
يستخدم البروتين الغشائي المعاد تكوينه ArcD لنقل L-arginine إلى و L-ornithine خارج الحويصلات ويستخدم مع الإنزيمات المغلفة ArcA و ArcB و ArcC لإعادة تدوير ATP من ADP والفوسفات غير العضوي. GlpT هو مضاد للحمل من الجلسرين 3-فوسفات / فوسفات مع GlpK ضروري لتخليق (وإفراز) الجلسرين 3-فوسفات من الجلسرين بالإضافة إلى ATP الناتج عن انهيار L-arginine. تؤدي إضافة 5 mM L-arginine عند t = 0 إلى البروتينات إلى زيادة حادة في نسبة مضان PercevalHR عند إثارة 500 و 430 نانومتر39 ، مما يعكس نسبة ATP / ADP داخل الحويصلات (الشكل 5). عند إضافة الجلسرين ، يتم استخدام ATP لتخليق الجلسرين 3-فوسفات ، مما يؤدي إلى خفض نسبة ATP / ADP28. يؤدي انهيار L-arginine أيضا إلى تغيرات في الأس الهيدروجيني ، والتي يمكن قياسها كميا باستخدام pyranine أو pHluorin27.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg"> الشكل 5: إعادة تدوير الأدينوسين الثلاثي الفوسفات بواسطة مسار انهيار إل-أرجينين. يتم وضع LUVs عند 2.7 مجم من الدهون / مل في كوفيت ويتم تسجيل نسبة التألق عند 500 نانومتر و 430 نانومتر. يضاف 5 mM من L- أرجينين عند t = 0. نسبة F500 / F430 هي مقياس لنسبة ATP / ADP داخل الحويصلات. اختصار: LUVs = حويصلات كبيرة أحادية الصفيحة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يمكن أيضا استخدام LUVs المنتجة ل ATP لتشكيل GUVs. تؤدي معالجة الجفاف للبروتيو-LUVs المجففة على هلام الأغاروز LGT إلى تكوين حويصلات بحجم ميكرومتر (الشكل 6). يعتمد تكوين البروتيو-GUVs داخل بقع LUV المجففة بشكل كبير على التركيز المحلي للدهون ودرجة الجفاف. تحتوي بعض المناطق على بقع كبيرة من GUVs ، بينما في أماكن أخرى في نفس القطرة ، لا يمكن تشكيل GUVs أو عدد قليل منها. ينتج عن تكوين GUVs عبر التورم بمساعدة الأغاروز LGT مجموعة من أحجام GUV ، عادة من بضعة ميكرومتر إلى أكثر من 50 ميكرومتر.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg"> الشكل 6: صور DIC للبروتيوGUVs التي تشكلت من تورم بمساعدة الهلام. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. الاختصارات: DIC = تباين التداخل التفاضلي ؛ GUVs = حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يتم حصاد GUVs واحتجازها في جهاز الموائع الدقيقة القائم على PDMS β-casein (الشكل 7). تم تصميم الجهاز بطريقة يمكن من خلالها احتجاز العديد من الحويصلات وتحليلها ضمن تجربة واحدة ، ويتم استخدام الجهاز للتحكم في البيئة الخارجية (معدل التدفق ، تكوين المخزن المؤقت ، إلخ.) 34. حتى عندما يكون محصول البروتينات - GUVs منخفضا ، فإن التدفق المستمر ل GUVs عبر رقاقة الموائع الدقيقة يمكن من جمع العديد من الحويصلات. بمجرد محاصرة عدد كاف من GUVs ، يتم غسل النظام بمخزن مؤقت متوازن تناضحيا لإزالة المكونات الخارجية مثل البروتينات القابلة للذوبان والجزيئات الصغيرة ومجسات الفلورسنت. ثم يتم استبدال مخزن الغسيل بمحلول ركيزة بأسمولية متساوية تحتوي على 50 mM KPi (درجة الحموضة 7.0) ، وكميات متفاوتة من الجلوكوز (لضبط الأسمولية) ، وركائز مثل 10 mM L-arginine. يتم إجراء تجربة سلسلة زمنية على عدة مصائد لرقاقة الموائع الدقيقة ويتم التقاط الصور كل 90 ثانية (إثارة 405 نانومتر و 488 نانومتر عند استخدام PercevalHR). علاوة على ذلك ، يتم التقاط صورة برايتفيلد في كل نقطة زمنية. نسبة شدة الانبعاث بعد الإثارة عند 488 و 405 نانومتر هي مقياس لنسبة ADP / ATP في الحويصلات.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg"> الشكل 7: محاصرة الحويصلات بشريحة الموائع الدقيقة. (أ) حبس الحويصلات، مصحوبا بالقدرة على التحكم في البيئة الخارجية ومعدل التدفق. (ب) ProteoGUVs محاصرة في جهاز الموائع الدقيقة ومثارة بليزر 405 نانومتر (أخضر) و 488 ليزر (أحمر). يتم قياس الانبعاثات لكلتا القناتين عند &gt;500 نانومتر. تسمح صورة برايت فيلد بتصور الحويصلات بدون مضان. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. اختصار: GUVs = حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

نقدم بروتوكولا لإعادة تكوين بروتينات الغشاء وتغليف الإنزيمات والمكونات الأخرى القابلة للذوبان في الماء في حويصلات دهنية بحجم دون ميكرومتر وميكرومتر.

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

في هولندا ، يهدف اتحاد BaSyC إلى بناء خلايا اصطناعية من المكونات الجزيئية. يتكون اتحاد BaSyC من مجموعات بحثية تتراوح من البيولوجيا الجزيئية إلى الكيمياء والفيزياء والعلوم الحاسوبية. الهدف من هذا الكونسورتيوم هو إنشاء نظام ذاتي التكرار قادر على النمو المستقل لنقل المعلومات والتقسيم.ونحن نركز حاليا على بناء الشبكات الجزيئية التي تتكامل مع الأنظمة الجزيئية الأكثر تعقيدا. تشمل التطورات الحديثة في البيولوجيا التركيبية هندسة وحدات للوظائف الخلوية ، ودمجها في شبكات معقدة للتطبيقات في التشخيص والعلاج والمناعة الاصطناعية والمواد التكيفية. يمتد هذا التقدم إلى مجموعات في أوروبا وأمريكا وآسيا ، مما يؤدي إلى تطوير كل من الأساليب من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى لبناء الخلايا الاصطناعية.تشمل التقنيات الحالية في مجالنا الأساليب الهندسية والتطورية لبناء وتحسين شبكات التمثيل الغذائي. نحن نستخدم الذكاء الاصطناعي للانتقاء الجزيئي والتقنيات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية المتقدمة لعزل المكونات وتشكيل الشبكة. نحن نستخدم أيضا إعادة تكوين الغشاء ، والتغليف المادي ، والتصور عبر التحليل الطيفي الفلوري والفحص المجهري.مع تكامل الوحدات ، يزداد عدد البروتينات والإنزيمات الغشائية بشكل كبير ، مما يفرض قيودا على تقنيات إعادة التكوين والتغليف لدينا. يصبح التغليف العشوائي مشكلة مع الحويصلات ذات الحجم دون الميكرون ، وتنخفض كفاءة تكوين حويصلات بحجم ميكرومتر عندما يتم إعادة تكوين بروتينات غشائية متعددة في الغشاء الدهني. في جرونينجن ، قمنا بتطوير شبكات التمثيل الغذائي لإنتاج ATP والحفاظ على حالة خارج التوازن من خلال تغذية الركيزة وتصدير المنتجات.بالإضافة إلى ذلك ، ربطنا إعادة تدوير ATP بتخليق وإفراز سلائف الدهون ، مما يمكن الحويصلات الثانوية من إنتاج الدهون ، وهو تقدم كبير في مجالنا.

construction-out-equilibrium-metabolic-networks-nano-micrometer-sized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

هنا نحن تصف طرق بسيطة لإعداد الحويصلات، والتغليف من النسخ وآلات الترجمة، ورصد إنتاج البروتين. نظم خالية من الخلايا الناتجة يمكن استخدامها كنقطة انطلاق من خلالها لبناء يقلد الخلوية تزداد تعقيدا.

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

يصف البروتوكول المقدم تحليل النقل بوساطة البروتين الغشائي على مستوى الناقل الفردي باستخدام طبقات ثنائية دهنية خالية من المذيبات الممتدة عبر المسام. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء رقائق مصفوفة نانوية منتجة بكميات كبيرة ، جنبا إلى جنب مع الحصول على البيانات وتحليلها متوازية للغاية ، مما يتيح الإنشاء المستقبلي لفحوصات مستجيب البروتين...

النقل غشاء عمليات تحليلها بواسطة النظام ثقب النانو رقاقة الموازي عالية في قرار بروتين واحد

تؤدي العديد من البروتينات وظيفتها عند ربطها بأسطح الغشاء. يمكن تصوير ارتباط البروتينات الخارجية على أغشية الأقراص النانوية بشكل غير مباشر عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال. نوضح أن التكديس المميز (رولو) للأقراص النانوية الناجم عن وصمة عار الصوديوم السلبية فوسفوتنجستات يتم منعه عن طريق ارتباط البروتين الخارجي.

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

شعور العديد من البروتينات في الخلية والحث على انحناء غشاء. يصف لنا طريقة لسحب الأنابيب النانوية الأغشية من الحويصلات الدهنية دراسة التفاعل بين البروتينات أو أي جزيء انحناء نشطة مع الأغشية منحنى في المختبر.

سحب الأنابيب النانوية الأغشية من الحويصلات أونيلاميلار العملاقة

المدعومة من الصلبة، خالية من البروتين، وضعف فسفوليبيد بلير الأغشية (دلبم) يمكن أن تتحول إلى شبكات أنابيب نانوية معقدة ودينامية في الدهون ويمكن أن تكون بمثابة 2D نماذج ينطلق من هيولى.

تشكيل عفوية وإعادة ترتيب شبكات أنابيب نانوية اصطناعية الدهن كنموذج التصاعدي هيولى

يصف هذا البروتوكول عملية لتصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية باستخدام حركية كينيسين الانزلاقية بالتزامن مع الحويصلات الدهنية أحادية الصفيحة العملاقة.

تصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية متعددة المكونات باستخدام اختبار حركية Kinesin المنزلق

في واجهة المذيبات العضوية والمائية ، تتجمع البروتينات الشبيهة بالإيلاستين المصممة خصيصًا في هياكل فوق جزيئية معقدة مثل الحويصلات والألياف والكواسيرفات التي تسببها المعلمات البيئية. تنتج بروتوكولات التجميع الموصوفة مقصورات تعتمد على الأغشية البروتينية (PMBCs) مع خصائص قابلة للسحب ، مما يتيح تغليف البضائع المختلفة.

توجيه تجميع البروتينات الشبيهة بالإيلاستين إلى هياكل فوق جزيئية محددة وتغليف البضائع في المختبر

في هذه المخطوطة، نوضح التقنيات التجريبية لتغليف الهيكل الخلوي F-actin في حويصلات دهنية عملاقة أحادية الصفيحة (وتسمى أيضا الجسيمات الشحمية)، وطريقة تشكيل طبقة F-actin تحاكي القشرة الحيوية في النشرة الداخلية للغشاء الشحمي.

في المختبر إعادة تشكيل الهيكل الخلوي للأكتين داخل حويصلات يونيلاميلار العملاقة

يصف البروتوكول الحالي تجميع الجسيمات الشحمية بمساعدة الأوكتانول (OLA) ، وهي تقنية ميكروفلويديك لتوليد الجسيمات الشحمية المتوافقة حيويا. تنتج OLA جسيمات ليبوزومات أحادية التشتت بحجم ميكرون مع تغليف فعال ، مما يسمح بإجراء تجارب فورية على الرقاقة. من المتوقع أن يكون هذا البروتوكول مناسبا بشكل خاص للبيولوجيا التركيبية وأبحاث الخلايا الاصطناعية.

تجميع الجسيمات الشحمية بمساعدة الأوكتانول على الرقاقة للهندسة الحيوية

تقدم هذه المقالة إعادة تشكيل بسيطة من وعاء واحد لشبكات الهيكل الخلوي داخل حويصلات عملاقة مفصولة عن الطور. يمكن تعميم الطريقة وتطبيقها على تغليف أو حبس مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية.

في المختبر إعادة تكوين شبكات الهيكل الخلوي داخل الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة المنفصلة عن الطور (GUVs)

اكتشف بروتوكول بناء شبكات التمثيل الغذائي خارج التوازن في حويصلات بحجم النانو والميكرومتر. يُمكّن هذا الأسلوب من إنشاء خلايا اصطناعية قادرة على النمو المستقل وتطبيقات في التشخيص والعلاج.

بناء شبكات التمثيل الغذائي خارج التوازن في حويصلات بحجم النانو والميكرومتر

استكشف المزيد من الفيديوهات