القياس الكمي لنشاط نظام إفراز اليرسينيا الكاذب من النوع الثالث بعد تجويع الحديد والنمو اللاهوائي
May 31st, 2024
تستعمر البكتيريا الأنسجة المضيفة التي تختلف في التوافر البيولوجي للأكسجين والحديد ، ومع ذلك فإن معظم طرق دراسة البكتيريا تستخدم وسائط غنية بالهواء يصف هذا البروتوكول استزراع العامل الممرض البشري Yersinia pseudotuberculosis تحت تركيزات متفاوتة من الحديد وتوتر الأكسجين ، وتحديد نشاط نظام إفراز Yersinia من النوع الثالث ، وهو عامل ضراوة مهم.
تستخدم مسببات الأمراض البكتيرية عوامل الفوعة لاستعمار منافذ مختلفة داخل الكائن الحي المضيف. نحن نعمل على فهم كيفية استشعار مسببات الأمراض البكتيرية لإشارات بيئية محددة في الأنسجة المضيفة لتنظيم تعبير عامل الضواعة. يستخدم العامل الممرض البشري Yersinia pseudotuberculosis عامل ضراوة نظام الإفراز من النوع الثالث لحقن البروتينات المستجيبة في الخلايا المضيفة.
يسمح نظام الإفراز من النوع الثالث للبكتيريا بتخريب آليات دفاع المضيف واستعمار الأنسجة المضيفة. ومع ذلك ، فإن التعبير عن نظام إفراز Yersinia من النوع الثالث مرهق من الناحية الأيضية ، لذلك يتم تنظيم التعبير عن جينات نظام الإفراز من النوع الثالث بشكل صارم استجابة للإشارات البيئية مثل درجة الحرارة. أظهرت منشوراتنا السابقة أن التعبير عن نظام إفراز اليرسينيا من النوع الثالث يتم التحكم فيه من خلال توافر الحديد وتوتر الأكسجين من خلال عامل نسخ يسمى ISCR.
هذه النتائج مهمة لأن يرسينيا تستعمر الأنسجة المضيفة التي تختلف في محتواها من الحديد وتوتر الأكسجين. على سبيل المثال ، يحتوي تجويف الأمعاء على ما يكفي من الحديد لنمو اليرسينيا ولكن لديه توتر أكسجين منخفض. في المقابل ، تحتوي الأنسجة مثل الدم على توافر منخفض جدا للحديد ولكن توتر أكسجين أعلى.
تسمح لنا طريقتنا بزراعة اليرسينيا في ظروف الاستزراع التي تختلف في كمية الحديد والأكسجين المتاحين ، لدراسة كيفية تأثير هذه الإشارات البيئية على التعبير عن نظام الإفراز من النوع الثالث. ستساعدنا هذه الطريقة في تحديد الآلية الجزيئية التي يتحكم من خلالها توافر الحديد والأكسجين في التعبير عن نظام الإفراز من النوع الثالث ، وتساعدنا على فهم كيفية تحكم ذلك في نتيجة عدوى اليرسينيا. للبدء ، قم برسم Yersinia السل الزائف على ألواح أجار مرق Lysogeny.
احتضن الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة. بمجرد تشكيل مستعمرات مرئية ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة معزولة في أربعة ملليلتر من وسائط M9. زراعته بين عشية وضحاها عند 26 درجة مئوية مع تهوية عند 250 دورة في الدقيقة.
ضع كوفيت يحتوي على المزرعة في مقياس طيف ، ثم قم بتخفيف المزرعة في 14 مل من وسائط M9 المخلبة المعقمة بدون مكملات الحديد لتحقيق قيمة OD600 تبلغ 0.1. ضع القوارير في شاكر 26 درجة مئوية واحتضانها لمدة ثماني ساعات. بعد اكتمال الحضانة ، استخدم الثقافة لبدء ثلاث ثقافات جديدة. اثنان للنمو اللاهوائي وواحد للنمو الهوائي.
للزراعة الهوائية ، قم بتخفيف المزرعة إلى قيمة OD600 بقيمة 0.1 في 14 مل من وسائط M9 المخلبة المعقمة دون مكملات الحديد. ثم استزراع التهوية عند 26 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. للزراعة اللاهوائية ، قم بتخفيف الثقافة في 14 مل من وسائط M9 المخلبة المعقمة إلى أنبوبين زجاجيين مغسولين بالحمض.
في الأنبوب الأول ، أضف كبريتات الحديد المعقمة بالترشيح إلى التركيز النهائي البالغ ملليغرام واحد لكل لتر. في الأنبوب الثاني ، أضف كبريتات الحديد للحصول على تركيز نهائي قدره 0.01 ملليغرام لكل لتر. احتضان كلا الأنبوبين في غرفة لاهوائية في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.
بعد ذلك ، قم بتحفيز نشاط نظام الإفراز من النوع الثالث عن طريق تحويل المزارع اللاهوائية إلى 37 درجة مئوية ، واستمرار الحضانة لمدة أربع ساعات. بعد ذلك ، قم بتخفيف الثقافات التي تنمو هوائية إلى قيمة OD600 البالغة 0.2 عن طريق إضافة 14 مل من وسائط M9 المخلبة إلى قارورتين مغسولتين بالحمض. أضف كبريتات الحديد بالتركيزات النهائية المطلوبة إلى القوارير.
احتضان كلا القواريرتين بالتهوية عند 26 درجة مئوية عند 250 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، قم بتحويل الثقافات إلى 37 درجة مئوية مع تهوية عند 250 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات للحث على نشاط نظام الإفراز من النوع الثالث. بعد تحفيز نظام الإفراز من النوع الثالث في Yersinia pseudotuberculosis ، قم بنقل الأحجام الطبيعية لهذه الثقافة المحتضنة إلى أنابيب سعة 15 ملليلترا.
أضف أربعة ميكرولترات من ألبومين مصل الأبقار إلى كل أنبوب للتحكم في ترسيب البروتين. الطرد المركزي للثقافات عند 3 ، 200 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بتصفية المادة الطافية في أنبوب جديد سعة 15 مليلتر باستخدام مرشح PVDF 0.22 ميكرون متصل بحقنة.
ثم أضف حمض ثلاثي كلورو أسيتيك ما يعادل 10٪ من حجم المادة الطافية. دوامة الأنابيب بقوة لمدة دقيقة واحدة. احتضان الأنابيب على الجليد في غرفة باردة عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
بعد ذلك ، أضف ملليلترين من كل عينة إلى أنبوب سعة ملليلترين ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 21 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. شفط المادة الطافية باستخدام ملحق فراغ. كرر سحب ملليلترين من العينة إلى نفس الأنبوب ، وجهاز الطرد المركزي ، وشفط المادة الطافية.
دمج تفاعلات هطول الأمطار في أنبوب واحد سعة ملليلتر. اغسل الكريات بملليلتر واحد من الأسيتون المثلج 100٪ متبوعا بالطرد المركزي وشفط المادة الطافية. بعد إزالة المادة الطافية للمرة الأخيرة ، جفف الحبيبات على المقعد لمدة ساعة واحدة.
يجب أن يبدو البروتين المترسب مثل الضباب على طول جانب الأنبوب. ثم, أعد تعليق كل حبيبات في 50 ميكرولتر من محلول F-S-B-DTT. دوامة جيدا لمدة دقيقة واحدة.
بعد ذلك ، قم بغلي العينات على كتلة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم ، جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة بأقصى سرعة في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل 15 ميكرولترا من كل عينة لاهوائية و 10 ميكرولتر من كل عينة هوائية إلى جل SDS-PAGE بنسبة 12.5٪ للتحليل.
بعد اكتمال تشغيل الجل ، استخدم تلطيخ الفضة لتصور البروتينات على الجل. للبدء ، ضع جل SDS-PAGE يحتوي على عينات هوائية منفصلة من مرض اليرسينيا الكاذب في نظام التصوير. في البرنامج ، حدد النطاقات التي تمثل بروتين مستجيب نظام الإفراز من النوع الثالث ، YopE ، عبر جميع الآبار.
اضبط نطاق YopE المرجعي على العينة المناسبة. تصدير قيم القياس الكمي النسبي المحسوبة بواسطة البرنامج لجميع نطاقات YopE. ثم حدد جميع نطاقات BSA عبر جميع الآبار.
تأكد من تطابق نطاق BSA المرجعي مع عينة نطاق YopE المرجعي. تصدير قيم القياس الكمي النسبية لجميع نطاقات BSA. اقسم قيمة YopE على قيمة BSA لكل شرط لإنتاج نتائج طبيعية.
كشف جل SDS-PAGE الملون بالفضة أنه في العينات اللاهوائية ، كان هناك 38 ضعفا من YopE في عينات الحديد المنخفضة مقارنة بعينات الحديد العالية. في العينات الهوائية ، تم إفراز هذه البروتينات بكميات متشابهة تقريبا.
النظرة العامة
تبحث هذه الدراسة في كيفية تنظيم المُمْرِض البشري Yersinia pseudotuberculosis لعامل الفوعة الخاص به، وهو نظام الإفراز من النوع الثالث، استجابة للإشارات البيئية مثل توفر الحديد وتوتر الأكسجين. تسلط الدراسة الضوء على العبء الأيضي للتعبير عن عامل الفوعة هذا والآليات المتضمنة في تنظيمه.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأحياء الدقيقة
- الباثوجينية
- التفاعلات بين المُمْرِض والمُضيف
الخلفية
- تستخدم العوامل المُمْرِضة البكتيرية عوامل الفوعة لاستعمار الأنسجة المضيفة.
- يعد نظام الإفراز من النوع الثالث ضروريًا لحقن بروتينات الفاعلية في الخلايا المضيفة.
- ينظم تعبير عوامل الفوعة الظروف البيئية.
- يؤثر توفر الحديد وتوتر الأكسجين بشكل كبير على تعبير نظام الإفراز من النوع الثالث في Yersinia pseudotuberculosis.
هدف الدراسة
- فهم كيفية استشعار Yersinia pseudotuberculosis للإشارات البيئية.
- التحقيق في تنظيم نظام الإفراز من النوع الثالث تحت ظروف متفاوتة.
- استكشاف الآثار الأيضية للتعبير عن عوامل الفوعة.
الطرق المستخدمة
- زراعة Yersinia pseudotuberculosis تحت تركيزات مختلفة من الحديد.
- تعديل توتر الأكسجين أثناء نمو البكتيريا.
- تحديد نشاط نظام الإفراز من النوع الثالث.
- تحليل الآليات التنظيمية المتضمنة في تعبير عوامل الفوعة.
النتائج الرئيسية
- ينظم Yersinia pseudotuberculosis نظام الإفراز من النوع الثالث استنادًا إلى مستويات الحديد والأكسجين.
- يكون تعبير نظام الإفراز من النوع الثالث مكلفًا من الناحية الأيضية ومتحكمًا به بإحكام.
- تؤثر الإشارات البيئية بشكل كبير على فوعة المُمْرِض.
- تساهم النتائج في فهم التكيف البكتيري في بيئات المضيف.
الاستنتاجات
- توفر الدراسة رؤى حول الآليات التنظيمية لعوامل الفوعة البكتيرية.
- يمكن أن يساعد فهم هذه الآليات في تطوير استراتيجيات لمحاربة العدوى البكتيرية.
- قد تستكشف الأبحاث المستقبلية عوامل بيئية إضافية تؤثر على الفوعة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of Yersinia pseudotuberculosis T3SS activity under iron starvation and anaerobic growth provides a robust framework for interrogating pathogen virulence regulation in host-relevant conditions. This approach enables mechanistic de-risking of antimicrobial targets by linking environmental cues to effector protein secretion, directly informing early-stage target validation and screening strategies. The method supports predictive confidence for antimicrobial discovery campaigns focused on T3SS inhibition.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of T3SS regulatory mechanisms in response to iron and oxygen, clarifying virulence pathway control.
- Supports functional target validation by quantifying effector secretion under defined environmental conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking for T3SS as an antimicrobial target.
- Provides a platform for hypothesis-driven evaluation of virulence factor modulation.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized protocols for inducing and quantifying T3SS activity in vitro.
- Enables reproducible measurement of secreted effector proteins using SDS-PAGE and silver staining.
- Supports assay readiness for compound screening targeting T3SS function.
- Allows normalization and quantitative comparison across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro conditions with host-relevant iron and oxygen environments encountered during infection.
- Facilitates translational continuity by modeling pathogen adaptation to mammalian tissue niches.
- Enables risk-adjusted advancement of T3SS-targeted candidates based on functional readouts.
- Provides a framework adaptable to other pathogens with robust iron uptake systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and preclinical validation for anti-virulence strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on environmental regulation of T3SS and virulence factor expression.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for effector secretion under defined conditions.
- Analytics: Enables normalization and statistical comparison of protein secretion across iron and oxygen gradients.
- Translational Research: Models pathogen behavior in host-like environments, informing preclinical candidate selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol for evaluating T3SS activity in diverse Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T3SS as a drug target by linking environmental cues to functional output.
- Operational Value: Standardizes effector quantification and assay conditions for cross-study comparability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for T3SS-targeted programs by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-virulence candidates based on mechanistic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culturing under controlled iron and oxygen conditions.
- Needs access to acid-washed glassware, chelated media, and protein quantification infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and quantification protocols.
- Adaptable to other pathogens with similar iron uptake systems, pending optimization.
- Dependent on accurate normalization and statistical analysis of effector protein outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:06
Yersinia pseudotuberculosis Culture Under Varying Oxygen Tension and Iron Levels
4:51
Trichloroacetic Acid Precipitation of T3SS Effector Proteins from Yersinia pseudotuberculosis Culture
7:19
Relative Quantification of T3SS Activity in Yersinia pseudotuberculosis Cultured in Varying Iron Levels and Oxygen Tension
8:14
Representative Results
