Name: عزل الخلايا البطانية البنكرياسية للفأر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: تعلم عزل الخلايا البطانية البنكرياسية للفأر باستخدام تقنية الفصل المغناطيسي والذي يكشف تفاعلات الأوعية الدموية في البنكرياس. يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لفهم وظائف الخلايا البطانية في الأمراض.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>تبسيط استخراج الخلايا البطانية للبنكرياس للفأر لدراسات المرض

<table><tbody><tr><td>1.5 مل eppendorf</td><td>الولايات المتحدة الأمريكية العلمية</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>طبق 10 سم</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>25G إبر</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q712-03-AA</td><td></td></tr><tr><td>5 مل eppendorf</td><td>Thermo Fisher &nbsp ؛</td><td>14282300</td><td></td></tr><tr><td>لوحة 6 آبار</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro ؛ مصفاة م</td><td>فيشر</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>مضاد CD31-البيوتين</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>REA784</td><td></td></tr> مصل <tr><td>الأبقار الألبومين صدمة حرارية معالجة</td><td>فيشر</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 فيشر</td><td></td> <td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الكولاجين نوع 1 ، من جلد العجل</td><td>Sigma Aldrich & نب سب.</td><td>C9791</td><td>كاشف المرفق في البروتوكول</td></tr><tr><td>Collagenase Type 1 &nbsp;</td><td>ورثينجتون بيو</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>كونتيسة عداد خلية</td><td>أوتوماتيكي ثيرمو فيشر &nbsp ؛</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>D1306</td><td>المناعي التألق</td></tr><tr><td>المناعي مشارط السلامة المتاح Myco</td><td>Instrumentation</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I & nbsp ؛</td><td>روش</td><td>260913&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Ca2 + ، Mg2 +) ثيرمو</td> <td>فيشر &nbsp ؛</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول</td><td>فيشر</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>فيشر</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>حاضنة</td><td></td><td></td><td>الإبقاء عليها عند 37 درجة ؛ C 5٪ CO2</td></tr><tr><td>LS الأعمدة</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand مع فاصل QuadroMACS &nbsp ؛</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads المضادة للبيوتين</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>مجهر</td><td>Leica</td><td></td><td>لتقييم مورفولوجيا الخلية</td></tr><tr><td>الجزيئية الصف المياه</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44 / 44R شاكر مداري &nbsp ؛</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) الجسم المضاد</td><td>Abcam</td><td>ab56299</td><td>التألق المناعي</td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) الأجسام المضادة</td><td>R & D Systems</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10X) (بدون Ca2 + ، لا Mg2 +)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>25-507-XB</td><td></td></tr><tr><td>Primer 36B4 Forward mouse</td><td>IDT</td><td></td><td>AGATTCGGGATATGCTGTTGGC</td></tr><tr><td>Primer 36B4 Revese mouse &nbsp ؛</td><td>IDT</td><td></td><td>TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC</td></tr><tr><td>التمهيدي Kdr الماوس الأمامي&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCAGAATCCTCTTCCATGC</td></tr><tr><td>Primer Kdr الماوس العكسي</td><td>IDT</td><td></td><td>AAACCTCCTGCAAGCAAATG</td></tr><tr><td>التمهيدي Nkx6.1 الماوس العكسي&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>CACGGCGGACTCTGCATCACTC</td></tr><tr><td>Primer Nxk6.1 الماوس الأمامي</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCTACTTTAGCCCAGCG</td></tr><tr><td>التمهيدي PECAM1 الماوس الأمامي</td><td>IDT</td><td></td><td>ACGCTGGTGCTATGCAAG</td></tr><tr><td>التمهيدي PECAM1 الماوس العكسي</td><td>IDT</td><td></td><td>TCAGTTGCTGCCCATTCATCA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher &nbsp;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNase ماء خال</td><td>من Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>معقم 12 بوصة ملقط طويل</td><td>FST</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>ملقط ناعم معقم</td><td>FST</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>مقص ناعم معقم</td><td>FST</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>أطباق زراعة الأنسجة 2 سم</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>كاشف TRIzol</td><td>فيشر</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>تريبان بلو</td><td>كورنينج</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>مثبط التربسين&nbsp;</td><td>روش</td><td>10109886001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin الأجسام المضادة</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>حوض مائي</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> مناعي</tbody></table>

عزل الخلايا البطانية البنكرياسية للفأر

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

باتباع هذا البروتوكول ، يمكن الحصول على ما يقرب من 2 × 106 خلايا حية عند تجميع 3 بنكرياس فأر و 750,000 خلية من بنكرياس فأر واحد. للتحقق من صحة تخصيب EC ، أجرينا التحليلات التالية: 1) تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي: مقارنة بعينات التدفق (FT) (أي الكسور المرتبطة بالأجسام المضادة غير CD31) ، كان لدى كسور EC مستويات أعلى بكثير من Pecam1 (ترميز CD31) و Kdr (ترميز VEGFR2) ، وجينان لعلامة EC33 ، ومستويات أقل من NK6 homeobox 1 (Nkx6.1) ، وهو عامل نسخ في خلايا الغدد الصماء في البنكرياس (الشكل 4 أ)); 2) النشاف الغربي: أظهرت العينات المخصبة ب EC من ثلاثة مستحضرات (pEC-1-3) إشارات قوية ل CD31 بالحجم المتوقع (~ 130 كيلو دالتون). وبالمقارنة ، أظهرت عينات المدخلات و FT إشارة CD31 ضئيلة. كعنصر تحكم إيجابي ، أظهرت محللات خلايا MS1 ، وهي خط خلية pEC ، إشارة CD31 قوية (الشكل 4 ب) ؛ 3) تلطيخ التريبان الأزرق: وجدنا أن صلاحية الخلايا المعزولة كانت حوالي 50٪ (الشكل 4 ج) ؛ 4) قياس التدفق الخلوي باتباع بروتوكول منشور15 : من خلال البوابات على مجموعة الخلايا الحية (الشكل 4D) ، وجدنا أن خلايا CD31 + كانت في 88٪ وخلايا TdTomato+ كانت في 76٪. وتجدر الإشارة إلى أن غالبية الخلايا المعزولة تشارك في التعبير عن CD31 و TdTomato (الشكل 4E). كعناصر تحكم سلبية ، لم تظهر خلايا MS1 غير الملوثة و MS1 المحتضنة ب IgG أي خلايا حية كما هو موضح ب CD31. كعنصر تحكم إيجابي ، أي أظهرت خلايا MS1 الملطخة ب CD31 ما يقرب من 100٪ خلايا CD31 + حية (الشكل 4F). قمنا أيضا بزراعة الخلايا المعزولة ، وأجرينا تلطيخا مناعيا من PECAM1 باتباع بروتوكول منشور36 ، وقمنا بتصوير TdTomato، الذي أظهر إشارات قوية لكلتا العلامتين في الخلايا المعزولة ، مما يشير إلى وجود ECs (الشكل 4G).
<img alt="مخطط البنكرياس يوضح ECs داخل الجزيرة لدراسة بنية الأوعية الدموية وتحليل التفاعل الخلوي." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
الشكل 1: رسم توضيحي للأوعية الدموية للبنكرياس وجزر البنكرياس. تصوير مصور للخلايا البطانية البنكرياسية (ECs) و ECs داخل الجزيرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="مخطط تحضير البنكرياس أحادي الخلية. الطرد المركزي ، وضع العلامات على البيوتين CD31 ، تحليل التدفق." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
الشكل 2: نظرة عامة على سير العمل. 1) تشريح البنكرياس ، 2) الهضم الميكانيكي ، 3) حضانة الإنزيم ، 4) الطرد المركزي ، 5 أ) إزالة المواد الطافية و 5 ب) هضم الكولاجيناز الثانوي لحبيبات الخلية مع التريتوري للتصفية في 6) ، 7) ، و 8) إعادة تشكيل الحبيبات وربط الأجسام المضادة ، 9) حضانة الميكروبيدات ، 10) تخصيب عمود MACS ، 11) عد الخلايا من أجل الجدوى ، و 12) تحليل المصب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="تشريح الأنسجة يظهر عملية حصاد البنكرياس وعزله وتشذيبه في البحوث البيولوجية." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
الشكل 3: خطوات معالجة الأنسجة. صور (أ) تجويف البطن ، (ب) بنكرياس الفأر المعزول ، و (ج) بنكرياس الفأر المشذب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="التعبير الجيني ، تحليل CD31 ، DAPI ، فرز الخلايا ، التألق ، ونتائج قياس التدفق الخلوي." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
الشكل 4: التحقق من صحة كسور EC المعزولة من بنكرياس الفأر. (أ) qPCR لعينات FT وجزء EC المخصب ب CD31 للتخصيب. Pecam1 (CD31) و Kdr (VEGFR2) و Nkx6.1 (عامل النسخ الخاص بخلايا β البنكرياس) 33. * يشير إلى p &lt;0.05 مقارنة ب FT بناء على اختبارات t . ن = 3-4 عينات مجمعة ، تتكون من 3 فئران لكل منها. (ب) النشاف الغربي ل CD31. يشير pEC-1-3 إلى ECs المخصبة من 3 عينات منفصلة من الماوس المجمع. تم تحميل محللات الخلايا بمقدار 30 مجم على كل حارة ، متبوعة بتلوين Ponceau S. (ج) عد الخلايا وتلوين الجرجير الأزرق ل pECs المخصبة لمقايسة الجدوى. (د) استراتيجية بوابات قياس التدفق الخلوي للفأر pECs الملطخة بالجسم المضاد 4 'و 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) و CD31. (ه) الرسوم البيانية لقياس التدفق الخلوي ل MS1 غير الملوثة (أعلى اليسار) ، MS1 ملطخ بالجسم المضاد الثانوي AlexaFluor-488 (التحكم في IgG ؛ أعلى اليمين) ، MS1 ملطخ ب CD31 (أسفل اليسار) ، و pECs المعزولة للفأر ملطخة ب CD31 (أسفل اليمين). (و) النسبة المئوية للخلايا الحية التي تم تحديدها كميا باستخدام قياس التدفق الخلوي. (ز) التألق المناعي لتعبير CD31 (أخضر) مع DAPI (أزرق) مضاد للبقع ومراسل الفلورسنت TdTomato الداخلي (أحمر). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="الفحص المجهري المناعي CD31 / CD144 / DAPI ، تحليل التعبير الجيني UMAP ل Cdh5 ، Pecam1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
الشكل 5: خصوصية CD31 و CD144 في بنكرياس الفأر. (أ) التألق المناعي لبنكرياس الفأر مع CD31 (أرجواني) و CD144 (سماوي) ، مع بقعة DAPI. تم التقاط الصورة باستخدام عدسة 10x تحت مجهر مقلوب فلوري واسع المجال. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. خطوط متقطعة تحدد منطقة الجزيرة. (ب) التقريب والإسقاط المنتظم للمشعب (UMAP) الذي يظهر تعبير Cdh5 و Pecam1 في ECs الجزیرية من الفئران C57BL6 التي تم اكتشافها بواسطة scRNA-seq (GSE128565)37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>انزيم</td>
			<td>استخدام</td>
			<td>درجة الحرارة والوقت</td>
			<td>مرجع</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كولاجيناز الأول</td>
			<td>تفكك الخلية المفردة ، تخصيب البنكرياس الكامل EC</td>
			<td>37 درجة مئوية ، 20 دقيقة</td>
			<td>هذا البروتوكول</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كولاجيناز الرابع</td>
			<td>عزل الجزيرة والتفكك غير الأنزيمي</td>
			<td>37 درجة مئوية ، 20 دقيقة</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كولاجيناز + تربسين</td>
			<td>فحص الخلايا القنوية في بنكرياس الفأر</td>
			<td>37 درجة مئوية ، 30 دقيقة</td>
			<td>47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كولاجيناز ب</td>
			<td>تعليق الخلية المفردة للبنكرياس</td>
			<td>37 درجة مئوية ، 30 دقيقة</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كولاجيناز NBI</td>
			<td>عزل الجزيرة</td>
			<td>37 درجة مئوية ، 30 دقيقة</td>
			<td>49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كولاجيناز ف</td>
			<td>نظام تعليق Acinar قابل للتطبيق</td>
			<td>37 درجة مئوية ، 15 دقيقة</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كولاجيناز الحادي عشر</td>
			<td>عزل الجزيرة</td>
			<td>37 درجة مئوية ، 15 دقيقة</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>متباينة</td>
			<td>تعليق خلية واحدة</td>
			<td>37 درجة مئوية ، 45 دقيقة</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ليبراس</td>
			<td>تعليق خلية واحدة</td>
			<td>37 درجة مئوية ، 10 دقائق</td>
			<td>25, 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>التربسين</td>
			<td>تفكك خلية واحدة ، بنكرياس كامل</td>
			<td>4 درجة مئوية ، O / N</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
الجدول 1: ملخص البروتوكولات المختلفة المستخدمة لمعالجة عينات البنكرياس من الفئران.

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and ...

isolation-of-mouse-pancreatic-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

جزر البنكرياس ، وتسمى أيضا جزر لانجرهانز ، هي مجموعة من خلايا الغدد الصماء التي تنتج هرمونات لتنظيم الجلوكوز والوظائف البيولوجية المهمة الأخرى. يشرح هذا البروتوكول طريقة لعزل جزر البنكرياس عن طريق نشر الكولاجيناز أولا عبر أمبولا فاتر لهضم أنسجة البنكرياس الخارجية والطرد المركزي المتدرج المبسط لتنقية الجزر من الفئران.

عزل جزر البنكرياس من خلال نضح الكولاجيناز: طريقة إنزيمية لعزل خلايا جزر البنكرياس

في هذا المنشور، نحن تصف الإجراء السريع ومريحة للعزل وزراعة الخلايا الأولية عنيبي البنكرياس من البنكرياس الفئران. يشكل هذا الأسلوب نهجا قيما لدراسة علم وظائف الأعضاء من خلايا البنكرياس الطازجة الأولية العادي / هو دون تغيير إفرازات.

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

نقدم هنا بروتوكولا لعزل الجزر الصغيرة عن نموذج الفأر لمرض السكري من النوع 2 ، Leprdb وتفاصيل اختبار الخلايا الحية لقياس إفراز الأنسولين من الجزر السليمة التي تستخدم 2 مجهر فوتون.

Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

هذا البروتوكول جاهز لمشاركة طريقتنا في عزل الخلايا البطانية التاجية للفأر لغرض التصوير أو لإجراء تجارب بيولوجية جزيئية.

عزل خلايا الفأر التاجي غشائي

نحن تصف بروتوكول هنا لعزل الجزر سليمة من الفئران حديثي الولادة. تم هضمها بنكرياسات جزئيا مع كولاجيناز، تليها الغسيل وقطف اليد. ويمكن الحصول على 80 مجموعات جزيرة في البنكرياس من الفئران الوليدة، والتي هي مناسبة لعدة دراسات خلايا البنكرياس - 20.

عزل فعال من الجزر وظيفية من الأطفال حديثي الولادة البنكرياس ماوس

وصف بروتوكول عزل الجزيرة هذا مسارًا جديدًا لحقن الكولاجين لهضم الأنسجة الخارجية وإجراء تدرج مبسط لتنقية الجزر من الفئران. وهو ينطوي على الهضم الأنزيمي، فصل التدرج / تنقية، ومجموعة انتقاء اليد. يمكن أن ينتج عن العزل الناجح 250-350 جزيرة عالية الجودة وكاملة التشغيل لكل ماوس.

بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران

نقدم هنا بروتوكولا لعزل خلايا البنكرياس جزيرة الماوس لفحص عروض توضيحية روس قبل xenobiotics بغية تحديد المواد الكيميائية إكسينوبيوتيك ديابيتوجينيك المحتملة.

لفحص يستند إلى الخلية جزيرة البنكرياس مورين للمواد الكيميائية البيئية ديابيتوجينيك

هنا ، نقدم بروتوكولا للتصوير وقياس ديناميات الكالسيوم في الخلايا غير المتجانسة السكان ، مثل خلايا جزيرة البنكرياس. يتم تسليم الصحفيين الفلورسنت إلى الطبقة الطرفية من الخلايا داخل الجزيرة ، والتي يتم بعد ذلك التعبئة والتصوير ، ويتم اجراء تحليل لكل خليه من ديناميات كثافة الفلورية.

تصوير ديناميات الكالسيوم في السكان الفرعيين من خلايا الفئران جزيرة البنكرياس

هنا نوجز ونوضح بروتوكولا لعزل الخلايا البطانية الجيبية الأولية لكبد الفأر (LSEC). يعتمد البروتوكول على تروية كولاجيناز الكبد ، وتنقية الخلايا غير المتنية عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة ، واختيار الخرزة المغناطيسية CD146. نحن أيضا النمط الظاهري ونوصيف هذه LSECs المعزولة باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجهر الإلكتروني الماسح.

عزل وتوصيف الخلايا البطانية الجيبية الأولية للكبد الفأر

في هذه المقالة ، تم عزل الخلايا البطانية الرئوية الأولية واستزراعها من الفئران حديثي الولادة.

عزل الخلايا البطانية لرئة الفأر الأولية

طورت هذه الدراسة طريقة مبسطة لاستخراج الجزر الأولية الوظيفية والخلايا الأسينارية بكفاءة من بنكرياس الفأر، مما يوفر أداة قيمة لدراسة التواصل بين الخلايا في مسببات مرض السكري الحاد الناتج عن التهاب البنكرياس.

طريقة بسيطة وسريعة للعزل المتزامن للجزر الأولية وخلايا البنكرياس الأولية من الفئران

تعلم عزل الخلايا البطانية البنكرياسية للفأر باستخدام تقنية الفصل المغناطيسي والذي يكشف تفاعلات الأوعية الدموية في البنكرياس. يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لفهم وظائف الخلايا البطانية في الأمراض.

عزل الخلايا البطانية البنكرياسية للفأر

استكشف المزيد من الفيديوهات