اختبار في المختبر لدراسة هجرة الصفائح الدموية باستخدام حبال أفيدين-بيوتين الوظيفية RGD

الصفائح الدموية ضرورية في منع فقدان الدم بعد إصابة الأوعية الدموية ، ومكافحة الالتهابات ، والحفاظ على سلامة الأوعية الدموية أثناء الالتهاب. في حين أن المقابس المرقئ تتطلب التنشيط الجماعي وتجميع الصفائح الدموية ، فإن دورها في حماية الأوعية الدموية الملتهبة يتم تنفيذه على مستوى الخلية الواحدة. في هذا السياق ، وجدت الدراسات الحديثة أن الصفائح الدموية يمكن أن تهاجر بشكل مستقل ، وهي عملية تعتمد على الاستشعار الميكانيكي لبيئتها الدقيقة اللاصقة.

يسمح هذا النهج بالتحكم الدقيق في خصائص لاصق الركيزة ويعمل كمقايسة بسيطة في المختبر لدراسة الآليات الكامنة وراء هجرة الصفائح الدموية. تشير النتائج إلى أن الصفائح الدموية المهاجرة المرتبطة بروابط الإنتجرين يمكن أن تمارس قوة قادرة على تعطيل رابطة أفيدين والبيوتين. يوفر هذا الاختبار طريقة بسيطة وموثوقة لتصور هجرة الصفائح الدموية.

إلى جانب تصوير الخلايا الحية ، سيساعدنا على فهم أفضل للتفاعل وتنظيم مكونات الهيكل الخلوي المختلفة في وظيفة الصفائح الدموية المهمة هذه. للبدء ، ينزلق غطاء زجاجي صوتي في حمض النيتريك بنسبة 20٪ لمدة دقيقة واحدة ، يليه صوتنة في الأيزوبروبانول والإيثانول والماء لمدة دقيقة واحدة لكل منهما. عالج زلات الغطاء التي تم تنظيفها مسبقا ببلازما الأكسجين في منظف البلازما لمدة دقيقتين ، ثم قم بتجميعها بشرائح لزجة.

الآن املأ القناة ب 2.5 ميكرولتر من PLL-PEG-biotin المخفف في 97.5 ميكرولتر من PLL-PEG واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من neutravidin-FITC واحتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من البيوتين cyclo-RGD ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS.

بعد تخدير الفأر وإزالة الجلد الصدري ، أدخل الإبرة بين الضلعين الثاني والثالث على الجانب الأيسر من القص لسحب الدم من القلب. امزج الدم مع مليلتر واحد من عازلة Tyrode وجهاز الطرد المركزي عند 70 جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل الفرامل ، ثم خذ الجزء العلوي الذي يحتوي على البلازما الغنية بالصفائح الدموية. تخلط مع ثلاثة ملليلتر من عازلة Tyrode وتضاف 100 نانوغرام لكل مليلتر من البروستاسيكلين لمنع تنشيط الصفائح الدموية.

بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي عند 1200 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية الحبيبات في 500 ميكرولتر من عازلة Tyrode. ثم ، باستخدام مقياس الدم ، قم بقياس عدد الصفائح الدموية.

للبدء ، خذ الصفائح الدموية للفأر في قنوات طلاء cRGD للبيوتين والنيوترافيدين والبيوتين وسجل هجرة الصفائح الدموية الحية باستخدام مجهر مقلوب مزود بحاضنة مرحلة. لحساب أرقام التصاق الصفائح الدموية أو الترحيل ، انقر بزر الماوس الأيمن على القائمة المنسدلة لأداة النقاط في شريط الأدوات وحدد الأداة متعددة النقاط. استخرج مسافة الهجرة من العينات الثابتة عن طريق قياس طول مسار الهجرة المطبوع في طلاء النيوترافيدين-FITC.

انقر بزر الماوس الأيمن على القائمة المنسدلة لأداة الخط المستقيم في شريط الأدوات وحدد أداة الخط اليدوي المجانية. لتحديد شكل الصفائح الدموية ، حدد الصورة والضبط والعتبة في شريط الأدوات لإنشاء أقنعة ثنائية عن طريق تقسيم الصفائح الدموية الفلورية. حدد واصفات الأشكال في تحليل وتعيين القياسات، ثم حدد عرض النتائج باستخدام تحليل الجسيمات وتحليلها.

أظهرت الصفائح الدموية هجرة مثالية عند تركيز 2.5٪ PLL-PEG-biotin. تم تقليل الهجرة في كل من كثافة الترابط المنخفضة والعالية. تنتشر الصفائح الدموية بشكل غير كاف عند كثافة 1٪ من الترابط ، ويشار إليها بانخفاض المساحة والمحيط ، مما يشير إلى عدم كفاية تنشيط الإنتجرين.

عند كثافة 2.5٪ من الترابط ، تنتشر الصفائح الدموية بشكل فعال ، مما يؤدي إلى تعطيل روابط cRGD والهجرة. تسببت كثافة الترابط العالية في انتشار الصفائح الدموية دون استقطاب ، مما قلل من الهجرة بسبب الفشل في كسر روابط cRGD.