تشخيص داء بعد الوفاة في عن طريق مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الحقيقي LN34 المحدث والمضاعف

داء قاتل بنسبة مئة بالمئة، ويتطلب تشخيصا دقيقا وسريعا لمن هم في أمس الحاجة إليه. الفحوصات المخبرية الموثوقة ضرورية جدا للسيطرة على داء. طورت مراكز السيطرة على الأمراض بروتوكول خطوة بخطوة لاختبار داء باستخدام PCR العكسي الكمي (RT-PCR)، باستخدام اختبار فيروس أليسا في الوقت الحقيقي المعتمد يسمى LN34، مما يمكن المختبرات من تحسين دقة التشخيص ودعم جهود الوقاية من داء.

لعقود، اعتمدت اختبارات داء على اختبارات الأجسام المضادة الفلورية المباشرة المسماة DFA أو FAT. ومع ذلك، تستخدم العديد من المختبرات الدولية أيضا RT-PCR لاختبار داء بسبب حساسيته ودقته الممتازة. اختبار DFA لداء يتطلب مجاهر متخصصة، وتخزين السلسلة التبريدية، وتدريبا متخصصا للموظفين، والمواد الكيميائية، وقد واجهت نقصا خلال السنوات الأخيرة، وأصبح PCR وRT-PCR مستخدمين على نطاق واسع الآن في اختبارات مسببات الأمراض.

تمتلك العديد من المختبرات بالفعل معدات وخبرات PCR وRT-PCR، كما تتوفر المواد الكيميائية اللازمة من البائعين التجاريين. التكلفة تشكل عائقا رئيسيا أمام اختبار داء في المناطق التي تشهد أكبر عدد من حالات داء البشرية. طورت مراكز السيطرة على الأمراض (CDC) شكلا متعدد الأبعاد من اختبار LN34، الذي يحسن ضوابط الجودة ويخفض التكلفة لكل عينة تم اختبارها.

يتم تطبيق RT-PCR بشكل متزايد في تشخيصات داء لأنه يستخدم على نطاق واسع لاختبار مسببات الأمراض الأخرى والنتائج سهلة التفسير. لكن استخدام اختبار معتمد أمر بالغ الأهمية، والتأكد من أن الاختبار يعمل كما هو متوقع أمر بالغ الأهمية. يتضمن بروتوكولنا خطوة بخطوة ضوابط الجودة، واعتبارات السلامة، وأفضل ممارسات PCR لمساعدة المختبرات على البدء.

للبدء، ارتد معدات الحماية الشخصية بما في ذلك نظارات الأمان، وغباء أمامي مغلق، وزوجين من القفازات. تنظيف وتعقيم سطح العمل بمركب الأمونيوم الرباعي، أو أي مطهر مناسب آخر لتعطيل فيروس داء. ضع وسادة ماصة مبطنة بالبلاستيك على سطح العمل، باستخدام مشرط نظيف للاستخدام مرة واحدة يمثل مقطعا عرضيا كاملا من جذع الدماغ والمخايخ.

للتوحيد واستخراج الحمض النووي الريبي أخيرا، قم بتقطيع الأنسجة المطلوبة باستخدام مشرط واحد الاستخدام. دهن النسيج المفروم بمسحة وانقل المسحة إلى أنبوب مملوء مسبقا بحاجز التجانس والخرز. بعد التخلص من القفاز الخارجي باستخدام مطهر QAC مخفف بمقدار 1:256، قم بتنظيف وتعقيم محطة العمل والمعدات وخارج أنابيب العينة.

قم بتوحش العينات باستخدام مضرب خرز صغير لمدة 60 ثانية. وفحص الأنابيب بصريا. اترك العينات لتستقر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

وأخيرا، قم بتنظيف وتعقيم محطة العمل والمعدات وخارج أنابيب العينة بمطهر QAC قبل الانتقال إلى استخراج الحمض النووي الريبي. للبدء، قم بإزالة التلوث السطحي لخزانة السلامة البيولوجية باستخدام QAC مخفف إلى 1:256. قم بتنظيف إضافي لإزالة الغبار أو الملوثات البيئية الأخرى.

ضع منصة عمل مبطنة بالبلاستيك على منصة العمل. ثم رتب المواد الكيميائية والعينات في خزانة السلامة البيولوجية. ضع جميع أنابيب الجمع في رف نظيف لأنابيب الطرد المركزي الدقيق.

املأ مسبقا أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر بسعة 300 ميكرولتر من الإيثانول 100٪ لكل عينة دماغية. قم بعمل طرد مركزي لعينات الدماغ الموحدة عند 10,000 إلى 16,000 جرام لمدة دقيقتين في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة. انقل المادة الفائقة الوردية الشفافة إلى أنبوب معقم جديد يحتوي على 100٪ إيثانول، والماصة للأعلى والأسفل لخلط ونقل 600 ميكرولتر من خليط فائض الإيثانول إلى عمود دوران في أنبوب تجميع.

قم بجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة حتى يمر السائل عبر العمود، ثم تخلص من التدفق وانقل كل عمود إلى أنبوب تجميع جديد. أضف 400 ميكرولتر من محلول الغسل المسبق للحمض النووي الريبي إلى كل عمود. قم بطرد المركزي بالخليط عند 10,000 إلى 16,000 جرام لمدة 30 ثانية ثم تخلص من تدفق الخليط من خلالها.

أعد كل عمود إلى نفس أنبوب الجمع وكرر خطوة الغسل المسبق مرة ثانية. بعد ذلك، أضف 700 ميكرولتر من مخزن غسيل RNA لكل عمود. الطرد المركزي على 10,000 إلى 16,000 جرام لمدة دقيقتين.

وننقلها بعناية إلى أنبوب خال من RNase. تخلص من التدفق وأنبوب التجميع، ثم قم بإزالة القفازات الخارجية وتخلصها. الآن أضف 50 ميكرولتر من DNase وماء RNase الخالي من ال RNase مباشرة إلى مصفوفة الأعمدة وحضن لمدة 30 ثانية.

ثم أضع الطرد المركزي على 10,000 إلى 16,000 جيلون لمدة دقيقة واحدة. انقل الحمض النووي الريبي بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ببرغي علوي مسطح تحت اللولب ويسمى أنبوب طرد مركزي دقيق لإجراء اختبار RT-PCR. للبدء، قم بإذابة مخزن RT-PCR خطوة واحدة، بدون تحكم في القالب، ماء خال من النوكليز، برايمر، ومجسات على الثلج، في مساحة تحضير الخلطة الرئيسية.

ضع إنزيم RT-PCR بخطوة واحدة على الثلج. احسب حجم كل مادة لأقراص LN34 المتبادلة والبيتا A Master Mixes. حدد الآبار لكل عينة بثلاث نسخ لاختبار LN34 متعدد الإرسال باستخدام خريطة لوحة بئر 96.

بعد الدوران والدوران، يتم توزيع 23 ميكرولتر من LN34 Multiplex Master Mix في كل بئر LN34 مخصص. لإعداد تفاعلات التحكم السلبية في القالب، أضف ميكرولترين من ماء بدرجة PCR إلى كل بئر تحكم في القالب السلبي. ضع صفيحة بئر 96 على الثلج.

نظف محطة العمل بنسبة 70٪ إيثانول. الآن في مساحة عمل إصدار القالب، إذابة عينات الحمض النووي الريبي والتحكم الإيجابي لاستخدام واحد من الحمض النووي الصناعي على الجليد. بعد الدوامة، تقوم أنابيب الطرد المركزي لفترة وجيزة بأنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على عينات RNA، بتوصيل ماصة بمقدار ميكرولترين من العينة أو الحمض النووي الريبي المثبت للتحكم في البئر المقابل.

بعد إضافة جميع العينات، ضع غطاء اللاصق البصري فوق الآبار لإغلاقها تماما. قم بعمل الطرد المركزي على اللوح بحرارة 500 جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم ضع اللوحة المغلقة في جهاز PCR في الوقت الحقيقي أو كمي معاير لأقراص العائلة وقوالب VIC Hex Report. اضبط الجهاز على معايير الدورة المناسبة.

بعد الانتهاء من التشغيل، اضبط قيم العتبة إلى 0.2 ل LN34 و0.05 لبيتا أكتين. تحقق من منحنيات عينة التحكم لأي مشاكل في الجودة. أظهر اختبار LN34 منحنيات تضخيم ناجحة مع نتائج إيجابية تجاوزت العتبة عند قيم عتبة دورة مميزة عند النظر إليها على مقياس لوغاريتمي.

ومنحنيات تضخيم السيجمويد على مقياس خطي لكل من LN34 وبيتا أكتين. أظهرت النتائج السلبية خطوطا مسطحة دون تضخيم. تم تحديد منحنيات تضخيم غير طبيعية مع بعض المنحنيات التي أظهرت زيادات خطية بدلا من سيغمويدية في الفلورة، مما يشير إلى نتائج غير نمطية.

أظهرت المخططات متعددة المكونات المقابلة إشارات فلورية متموجة غير منتظمة بدلا من منحنيات ناعمة متوقعة. مع تسليط الضوء على الحاجة إلى تحليل مخططات التضخيم بدلا من الاعتماد فقط على قيم عتبة الدورة.