Name: إنشاء نموذج زرع الجنين في المختبر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: اكتشف نموذج زرع الجنين في المختبر لدراسة التفاعلات بين الجنين والبطانة الرحمية. يُظهر البحث تأثيرات الهرمونات على معدلات الزرع ويقدم استراتيجيات لتحسين نتائج التلقيح الصناعي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم دراساتنا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82171603) ، ومؤسسة لجنة الصحة البلدية في شنغهاي (202140341) ، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (23JC1403803) ، وبرنامج تعزيز الابتكار التابع ل NHC و Shanghai Key Labs ، SIBPT (RC2023-02).

تم إجراء مناولة الفئران والدراسات التجريبية بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة التابعة لمعهد شنغهاي للتقنيات الطبية الحيوية والصيدلانية. ضمان إجراءات السلامة: احرص دائما على ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند التعامل مع المواد الكيميائية أو المواد البيولوجية.
1. اقتناء أجنة الفئران
ملاحظة: يصف هذا القسم عملية الحصول على أجنة الفئران. تم الحفاظ على إناث الفئران البالغة (6-8 أسابيع ، الهجين C57BL / 6 و DBA / 2) في ظل الظروف البيئية القياسية من 12 ساعة خفيفة و 12 ساعة مظلمة عند 20-25 درجة مئوية ورطوبة 40-60٪ مع توفير الطعام والماء حسب الحاجة.
<ol><li>حقن إناث الفئران داخل الصفاق مع 10 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل (PMSG) ثم حقنها ب 10 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG) بفاصل 42-48 ساعة.</li>
	<li>تزاوج كل أنثى فأر مع ذكر من نفس العمر وتحقق من وجود سدادة مهبلية في صباح اليوم التالي. ملاحظة: السدادة المهبلية عبارة عن كتلة صفراء فاتحة من التحميلة تتشكل بعد تصلب السائل المنوي عند فتحة المهبل.</li>
	<li>القتل الرحيم للفئران الإناث مع المقابس المهبلية عن طريق استنشاق CO2 .</li>
	<li>فتح البطن وتحديد موقع الأعضاء التناسلية الأنثوية. تمتد قناة البيض والمبيض ومنصات الدهون مع ملقط. قطع قناة البيض والمبيض بالمقص. ثم قطع قناة البيض والرحم (الشكل 1).</li>
	<li>نقل قناة البيض التي تم الحصول عليها إلى طبق بتري 35 ملم مملوءة مسبقا مع M2 المتوسطة. ملاحظة: يجب تسخين وسط M2 في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>ثقب الأمبولة المتضخمة لقناة البيض بإبرة 25 جم لتحرير أو قرصة مجمع الركام والزيجوت (الشكل 2).</li>
	<li>استخدم الملقط لنقل مركب الركام والزيجوت إلى محلول M2 يحتوي على 0.5 مجم / مل هيالورونيداز واحتضانه لعدة دقائق حتى تتفكك الخلايا الركامية (الشكل 3).</li>
	<li>اجمع الزيجوت باستخدام ماصة نقل البويضات واغسلها في وسط M2 يحتوي على 4 مجم / مل BSA لإزالة الهيالورونيداز المتبقي والخلايا الركامية والشوائب.</li>
</ol>2. في الثقافة المختبرية لجنين الفأر
ملاحظة: يفصل هذا القسم عملية زراعة أجنة الفئران في المختبر من الزيجوتات إلى الكيسات الأريمية. يجب تحضير قطرات صغيرة لثقافة KSOM قبل 24 ساعة لضمان درجة الحرارة وتوازن الغاز.
<ol><li>تحضير 12 قطرة صغيرة من وسط KSOM ، كل منها بحجم 20 ميكرولتر ، في الجزء السفلي من طبق بتري 35 مم. قم بتغطية القطرات الدقيقة ب 3-5 مل من الزيت المعدني (الشكل 4) ، وضع أطباق بتري في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 للتوازن.</li>
	<li>انقل أجنة الفأر من وسط M2 إلى وسط KSOM باستخدام ماصة نقل للغسيل الشامل. ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة مجهرا مجسما بمرحلة تسخين 37 درجة مئوية. تقليل مدة التعامل مع الأجنة خارج الحاضنة.</li>
	<li>ضع الأجنة المغسولة في قطرات KSOM الدقيقة المحضرة واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 4 أيام. ملاحظة: لضمان التغذية الكافية ، قم بزراعة 5-10 أجنة لكل 20 ميكروقطرة ميكرولتر.</li>
	<li>حدد الكيسات الأريمية المفيدة وفقا لحجمها (100-130 ميكرومتر) ، وكتلة الخلية الداخلية (تتكون كتلة الخلية الداخلية من العديد من الخلايا المضغوطة جميعها) ، وعدد خلايا الأرومة الغاذية (الأدمة الغاذية المكونة من العديد من الخلايا المتماسكة والمعبأة معا) ، ودرجة التوسع (تحتل البلاستوكول 80-100٪ من الجنين).</li>
</ol>3. تحضير خلايا بطانة الرحم
<ol><li>داخل خزانة السلامة الحيوية ، قم بشفط 1 مل من الجيلاتين بنسبة 2٪ باستخدام ماصة ووزعها في طبق استزراع مكون من 12 بئرا. قم بتدوير اللوحة برفق لضمان تغطية كاملة للقاع بالجيلاتين. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بشفط الجيلاتين الزائد واترك قاع اللوحة يجف تماما.</li>
	<li>بعد اكتمال عملية الطلاء ، قم بزراعة خلايا سرطان بطانة الرحم الغدي البشري (إيشيكاوا) مع DMEM / F12 (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ، 1 mM بيروفات الصوديوم ، 2 mM L-glutamine ، 100 μg / mL streptomycin ، و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين ، وزرعها في ألواح 12 بئر مغلفة بالجيلاتين (2 × 105خلايا / بئر) ، واحتضانها لمدة 24 ساعة.</li>
</ol>4. تعلق الجنين
<ol><li>ضع برفق 5-15 كيسا أريميا طازجا في كل بئر من الصفيحة المكونة من 12 بئرا والتي تحتوي على خلايا إيشيكاوا المحضرة في الخطوة السابقة للزراعة المشتركة (الشكل 5).</li>
	<li>بعد 48 ساعة من الحضانة ، راقب الأجنة تحت المجهر لتقييم حالة تعلقها. لمراقبة تعلق الجنين ، حرك اللوحة بسرعة ثلاث مرات. ستظهر الأجنة غير المرتبطة حركة عائمة أو متدحرجة على سطح خلايا إيشيكاوا.</li>
	<li>حساب معدل زرع الجنين باستخدام المعادلة (1) ؛ استخدم معدل التصاق الجنين لتمثيل تأثير الزرع. معدل زرع الأجنة = (الأجنة المرفقة / إجمالي عدد الأجنة المزروعة) × 100٪ (1)</li>
</ol>

تقييم التصاق الأجنة في نموذج الثقافة المشتركة في المختبر مع خلايا إيشيكاوا

<ol><li>Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+study+of+human+embryo+implantation%3A+choice+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines.</a> Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).</li>
<li>Li, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+method+to+quantify+embryo+attachment+to+endometrial+epithelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).</li>
<li>Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+trophoblast+to+uterine+epithelium+as+related+to+the+state+of+trophoblast+differentiation%3A+in+vitro+studies+using+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines.</a> Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).</li>
<li>Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+in+vitro+model+of+human+embryo+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">A high-throughput in vitro model of human embryo attachment.</a> Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).</li>
<li>Karvas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+trophoblast+organoids+model+human+placental+development+and+susceptibility+to+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens.</a> Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li>
<li>Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+implantation+in+the+laboratory%3A+an+update+on+current+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques.</a> Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).</li>
<li>Berneau, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+osteopontin+in+an+in+vitro+model+of+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation.</a> Cells. 8 (5), 432(2019).</li>
<li>Jiang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HOXA10+sumoylation+inhibits+embryo+implantation+in+women+with+recurrent+implantation+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure.</a> Cell Death Discov. 3, 17057(2017).</li>
<li>Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteopontin-integrin+%CE%B1v%CE%B23+interaction+at+implantation%3A+functional+analysis+using+three+different+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models.</a> Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).</li>
<li>Duan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+exposure+to+supraphysiological+estradiol+during+ovarian+stimulation+increased+the+risk+of+adverse+perinatal+outcomes+after+frozen-thawed+embryo+transfer%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study.</a> J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+%CE%B21+and+%CE%B23+are+biomarkers+of+uterine+condition+for+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer.</a> J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgelin+2+is+required+for+embryo+implantation+by+promoting+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization.</a> FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).</li>
<li>Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+1+increases+apical+fibronectin+in+blastocysts+to+increase+blastocyst+attachment+to+endometrial+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro.</a> Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).</li>
<li>Kang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-145+suppresses+embryo-epithelial+juxtacrine+communication+at+implantation+by+modulating+maternal+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R.</a> J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).</li>
<li>Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ulipristal+acetate+on+human+embryo+attachment+and+endometrial+cell+gene+expression+in+an+in+vitro+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system.</a> Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+human+endometrium+for+studying+trophoblast-endometrium+interaction+during+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation.</a> Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).</li>
<li>Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+human+endometrium%3A+evolution+and+application+for+women%27s+health%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health.</a> Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).</li>
<li>Ahn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microengineered+vascularised+endometrium-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip.</a> Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).</li>
<li>Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mechanical+forces+change+the+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle+in+preparation+for+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation.</a> Cells. 10 (8), 2008(2021).</li>
</ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح المالية أو غيرها للإعلان عنه.

توفر بساطة وسرعة النموذج المختبري المقترح لزرع الجنين مزايا ملحوظة لفحص الأدوية في المراحل المبكرة والتطبيقات البحثية الأخرى. البروتوكول المباشر ، إلى جانب الطبيعة عالية الإنتاجية لخطوط خلايا إيشيكاوا ، يجعله مرشحا مثاليا للشاشات واسعة النطاق ، لا سيما في المراحل المبكرة من اكتشاف الأدوية. وجد Liang13 أن ضربة قاضية TAGLN2 قللت من قدرة غزو خلايا الأرومة الغاذية. أظهر Green14 أن عامل النمو الشبيه بالأنسولين قد حسن كفاءة التصاق الكيسة الأريمية للفأر بناء على نظام خلايا إيشيكاوا الجنينية للفأر. لا يسمح النموذج بالتقييم السريع للأدوية المرشحة فحسب ، بل يسهل أيضا دراسة الجزيئات الأخرى ، مثل السيتوكينات وعوامل النسخ ، التي تلعب دورا في زرع الجنين15,16. بالنظر إلى الآثار الكبيرة لزرع الأجنة في علم الأحياء الإنجابي ، فإن هذا النموذج يبشر بالخير لتعزيز فهمنا للآليات الأساسية وتطوير علاجات جديدة.
في حين أن النموذج الحالي في المختبر يوفر أداة قيمة لدراسة زرع الجنين ، فمن المهم الاعتراف بحدوده. كونه نظام ثقافة 2D ، فإنه يفتقر إلى تعقيد 3D في بيئة الجسم الحي 17 ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على تفاعلات الخلايا والخلايا ومسارات الإشارات. لذلك ، في حين أن النموذج يمكن أن يوفر رؤى أولية حول تأثيرات الجزيئات المختلفة على التصاق الجنين ، يجب اعتباره أداة فحص بدلا من استبدال الدراسات في الجسم الحي . يمكن أن تتضمن الاتجاهات المستقبلية تطوير أنظمة ثقافة 3D أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية تلخص بشكل أفضل البيئة المكروية المعقدة لبطانة الرحم18 ، مما يتيح تنبؤات أكثر دقة للاستجابات الدوائية والآليات الجزيئية. بالإضافة إلى ذلك ، سيكون من المفيد استكشاف تكامل هذا النموذج مع التقنيات المتقدمة الأخرى ، مثل الموائع الدقيقة وأنظمة الأعضاء على الرقاقة19،20 لزيادة تعزيز أهميته الفسيولوجية وقدراته التنبؤية.
أثناء عملية العلاج الإنجابي المساعد ، يهدف الإباضة الفائقة إلى تعزيز إنتاج البويضات في المبايض ، وبالتالي زيادة فرص الحمل. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي هذا الإجراء إلى زيادة ملحوظة في مستويات هرمون الاستروجين ، متجاوزا العتبة الفسيولوجية الطبيعية. هرمون الاستروجين ، وهو هرمون حيوي في تكاثر الإناث ، مسؤول عن تعزيز تكاثر بطانة الرحم وخلق بيئة مواتية لزرع الجنين. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه ينظم توازن الهرمونات التناسلية الأخرى ، بما في ذلك هرمون البروجسترون. باستخدام نموذج في المختبر ، تكشف النتائج التي توصلنا إليها أنه في حين أن الزيادة في تركيز هرمون الاستروجين تعزز في البداية معدلات زرع الجنين ، فإن المستويات العالية للغاية خارج النطاق الفسيولوجي تعيق هذه العملية بشكل كبير. والجدير بالذكر أن مكملات البروجسترون يمكن أن تتصدى بشكل فعال لهذا التأثير المثبط. تشير هذه الملاحظات إلى أن مستويات هرمون الاستروجين المرتفعة بشكل غير طبيعي أثناء الإباضة الفائقة قد تكون عاملا مساهما في انخفاض معدلات الزرع التي لوحظت سريريا المرتبطة بنقل الأجنة الطازجة مقارنة بعمليات نقل الأجنة المجمدة. علاوة على ذلك ، فإن مكملات البروجسترون بعد الزرع تبشر بالخير في تعزيز معدلات نجاح زرع الجنين.
لقد أنشأنا نهجا مباشرا وفعالا من حيث التكلفة ويمكن الاعتماد عليه للكشف عن زرع الجنين. عند وصول أجنة الفئران إلى مرحلة الكيسة الأريمية من خلال الزراعة في المختبر ، تمت زراعتها بشكل مشترك مع خلايا إيشيكاوا. يسمح هذا الإعداد التجريبي بفحص دور ووظيفة الجزيئات المختلفة ، مثل السيتوكينات والأدوية وعوامل النسخ ، في المراحل المبكرة من زرع الجنين. على الرغم من أن خطوط الخلايا الراسخة مثل خلايا إيشيكاوا قد لا توفر أنظمة النماذج الأكثر صلة من الناحية الفسيولوجية عند إقرانها بأجنة بشرية أو فأر ، إلا أن قدرتها على التكيف وقدراتها الإنتاجية العالية تجعلها مثالية لفحص الأدوية على نطاق واسع في المراحل المبكرة. في حين أن نماذج 2D في الثقافة المختبرية التي أنشأناها تتطلب مزيدا من التحسين ، إلا أنها تضع أساسا لنمذجة بطانة الرحم المثالية.

زرع الجنين ، الخطوة الأولى للحمل الناجح ، أمر بالغ الأهمية لفهم أساسه البيولوجي ومواجهة تحديات العقم. ومع ذلك ، فإن القيود الأخلاقية تفرض قيودا كبيرة في جمع عينات الأجنة السريرية البشرية ، مما يعيق البحث في التفاعلات المعقدة بين الأجنة البشرية وبطانة الرحم أثناء الحمل المبكر1. إن الفهم العميق لهذه الآليات المعقدة أمر حيوي للنهوض بالبحوث البيولوجية الأساسية واكتشاف الأدوية والصحة الإنجابية.
استخدمت النماذج السابقة في المختبر نماذج الالتصاق حيث تمت زراعة الخلايا الظهارية البطانية البشرية أحادية الطبقة (RL95-2) 2 مع بدائل جنينية ، مثل خلايا BeWo أو JAr أو Jeg-3 3المشيمية . ومع ذلك ، فإن اختيار حجم الكرويات ، الذي يتراوح بين 70-100 ميكرومتر ، كان أمرا بالغ الأهمية لأن مجاميع الخلايا الأكبر أو الأصغر يمكن أن تضر بدقة التجربة. والجدير بالذكر أن 25٪ فقط من الأجسام الكروية في كل مستحضر استوفت معيار الحجمالمناسب 4 ، وكانت هناك اختلافات كبيرة مقارنة بالظروف الفسيولوجية للأكياس الأريمية.
علاوة على ذلك ، توفر أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد (3D) لبطانة الرحم والكيسة الأريمية بيئة أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية5 ، ولكنها تتطلب خبرة تقنية عالية ، وبطء نمو الخلايا ، وارتفاع تكاليف الموارد والصيانة ، وصعوبة في التوحيد القياسي ، وانخفاض قابلية التكاثر6.
في هذا البروتوكول ، نقدم نموذجا فعالا من حيث التكلفة وسريعا في المختبر لزرع الجنين يمكن تطويره واستخدامه في معظم المختبرات. الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير منصة موثوقة وقابلة للتكرار لدراسة التفاعلات بين الأجنة وبطانة الرحم في بيئة خاضعة للرقابة. من خلال محاكاة الأحداث الرئيسية لزرع الأجنة في المختبر ، يهدف هذا النموذج إلى سد الفجوة بين النماذج الحيوانية والإعدادات السريرية ، مما يتيح إجراء أبحاث أكثر دقة واستهدافا.
بالمقارنة مع البدائل الجنينية ، يوفر استخدام الكيسات الأريمية للفأر تمثيلا أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لعملية زرع الجنين في الجسم الحي7. بالإضافة إلى ذلك ، يمتلك خط خلايا إيشيكاوا ، المشتق من سرطان بطانة الرحم الغدي البشري ، خصائص مختلطة من الظهارة الغدية وظهارة تجويف الرحم1 ، مما يمكنه من التعبير عن الإنزيمات والبروتينات الهيكلية ومستقبلات الستيرويد الوظيفية المشابهة لتلك الموجودة في بطانة الرحم الطبيعية ، وبالتالي توفير ركيزة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لزرع الجنين. تتيح بساطة وسرعة نظام الثقافة المشتركة إجراء فحص عالي الإنتاجية واختبار الأدوية8،9،10. من خلال توفير منصة قوية وقابلة للتكرار ، توفر هذه الطريقة فرصة لتعزيز فهمنا لزرع الأجنة وتأثيرها على صحة الإنسان.

<table><tbody><tr><td>17-&amp;-estradiol</td><td>SIGMA</td><td>3301</td><td>أقوى هرمون الاستروجين للثدييات</td></tr><tr><td>BD Falcon</td><td>BD</td><td>353001</td><td>أطباق بتري البكتريولوجية 35 × 10 مم نمط ث / غطاء محكم ، بوليسترين عذراء من الدرجة الكريستالية ،</td></tr><tr><td>خزانة السلامة الحيوية</td> المعقمة <td>ESCO</td><td>Class <img alt="المعادلة 1" src="/%20%D8%A7%D9%84%D9%85%D9%84%D9%81%D8%A7%D8%AA%20/%20ftp_upload/66873%20/%2066873eq01.jpg" style="الهامش: تلقائي ؛ ">BSC</td><td>عمليات معقمة ، وصنع أطباق الاستزراع ، والكواشف ، وما إلى</td></tr> ذلك <tr><td>CO2&lt; / sub&gt; حاضنة</td><td>Thermo</td><td>8000DH</td> لوحة <td>ثقافة زراعة الأجنة</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3506</td><td>زراعة الخلايا</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>1133032</td><td>DMEM / F12 (1x) ، سائل 1: 1 ، يحتوي على L-glutamine و 15 ملي مولار HEPES عازلة</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>Gibco</td><td>مصل 10099141</td><td>الأبقار الجنينية ، مؤهل ، أستراليا المنشأ</td></tr><tr><td>الجيلاتين</td><td>SIGMA</td><td>G9391</td><td>النوع B ، مسحوق ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا</td></tr><tr><td>HCG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2520</td><td>كاشف التعقيم ، الحقن داخل الصفاق ، 50 وحدة دولية / مل</td></tr><tr><td>Hyaluronidase &amp;nbsp ؛</td><td>SIGMA</td><td>V900833</td><td>الصف كاشف ، مسحوق &amp;nbsp ؛</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-D</td> <td>(1x) ، مسحوق ، بدون فينول أحمر ، 5 × 10 مل</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>L-glutamine-200 mM (100x) ، سائل</td></tr><tr><td>M2</td><td>Merck</td><td>MR-015-D</td><td>EmbryoMax M2 متوسط (1x) ، سائل ، مع</td></tr><tr><td>زيت معدني أحمر الفينول &amp;nbsp ؛</td>الزيوت المعدنية <td>SIGMA</td><td>M8410</td><td>مناسبة للاستخدام كطبقة غطاء للتحكم في التبخر والتلوث المتبادل في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية المختلفة</td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين ، سائل</td><td>جيبكو</td><td>15140122</td><td>10,000 وحدة بنسلين (قاعدة) و 10,000 وحدة ستربتومايسين (قاعدة) ، باستخدام البنسلين G (ملح الصوديوم) وكبريتات الستربتومايسين في محلول ملحي 0.85٪</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2620</td><td>كاشف التعقيم ، الحقن داخل الصفاق ، 50 وحدة دولية / مل</td></tr><tr><td>البروجسترون</td><td>SIGMA</td><td>5341</td><td>هرمون الستيرويد الذي يفرزه الجسم الأصفر خلال النصف الأخير من الدورة الشهرية</td></tr><tr><td>بيروفات الصوديوم</td><td>جيبكو</td><td>11360070</td><td>يضاف بيروفات الصوديوم بشكل شائع إلى وسائط زراعة الخلايا كمصدر للكربون بالإضافة إلى الجلوكوز</td></tr><tr><td>المجهر المجسم</td><td>أوليمبوس</td><td>SZX7</td><td>استرجاع الأجنة ومراقبة نمو الجنين</td></tr></tbody></table>

إنشاء نموذج زرع الجنين في المختبر

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

زرع الجنين هو الخطوة الأولى في تأسيس حمل ناجح. يعد النموذج المختبري لزرع الأجنة أمرا بالغ الأهمية للبحث البيولوجي الأساسي وتطوير الأدوية والفحص. تقدم هذه الورقة نموذجا بسيطا وسريعا وعالي الكفاءة في المختبر لزرع الجنين. في هذا البروتوكول ، نقدم أولا اكتساب الكيسة الأريمية للفأر وتحضير خلايا سرطان بطانة الرحم الغدي البشري (إيشيكاوا) للزرع ، تليها طريقة الزراعة المشتركة لأجنة الفئران وخلايا إيشيكاوا. أخيرا ، أجرينا دراسة لتقييم تأثير التركيزات المتفاوتة من 17-β-استراديول (E2) والبروجسترون (P4) على معدلات التصاق الجنين بناء على هذا النموذج. كشفت النتائج التي توصلنا إليها أن التركيزات العالية من E2 قللت بشكل كبير من التصاق الجنين ، في حين أن إضافة البروجسترون يمكن أن يعيد معدل الالتصاق. يوفر هذا النموذج منصة بسيطة وسريعة لتقييم وفحص الجزيئات المشاركة في عملية الالتصاق ، مثل السيتوكينات والأدوية وعوامل النسخ التي تتحكم في الزرع وتقبل بطانة الرحم.

في عملية تقنيات الإنجاب المساعدة ، يعد فرط تحفيز المبيض الخاضع للرقابة (COH) خطوة حاسمة ، مما يؤدي إلى ارتفاع مستويات هرمون الاستروجين بشكل كبير لدى المرضى بأكثر من 10-20 مرة مقارنة بالدورات الطبيعية11. بالنظر إلى هذا السياق ، سألنا عما إذا كانت تركيزات هرمون الاستروجين العالية في الدم تؤثر على زرع الجنين أثناء نقل الأجنة الطازجة. بناء على نموذج زرع الجنين هذا ، درسنا تأثيرات التركيزات المختلفة ل E2 و P4 على معدلات زرع الجنين12. بعد علاج الجوع ، تم تحضين خلايا إيشيكاوا ب E2 (0 و 0.1 و 1 و 10 و 100 نانومتر) أو مزيج من E2 و P4 (0-0 و 100-0 و 100-10 و 100-100 نانومتر) لمدة 48 ساعة. ثم تم نقل الخلايا إلى ألواح 12 بئرا مغلفة بالجيلاتين ، وأضيفت 5-15 كيسا أريميا إلى كل بئر. تم تكرار كل مجموعة 3x ، وتم تحديد معدلات الزرع بعد 48 ساعة.
أظهرت النتائج أن التركيزات شبه الفسيولوجية ل E2 (10 نانومتر) زادت من معدلات زرع الجنين مقارنة ب 0 نانومتر E2. ومع ذلك ، فإن التركيزات العالية جدا من E2 (100 نانومتر) قللت بشكل كبير من معدلات زرع الجنين. خففت إضافة P4 اعتمادا على الجرعة من الآثار السلبية ل E2 المرتفع للغاية على الزرع (الشكل 6). بناء على هذا النموذج في المختبر ، نوضح الآثار السلبية لتركيزات هرمون الاستروجين غير الفسيولوجية العالية على زرع الجنين ونقدم المزيد من تطبيق هذا النموذج في البحث العلمي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig01.jpg"> الشكل 1: استئصال قناة البيض الفأر. قم بتمديد قناة البيض والمبيض والدهون بالملقط ، وقم أولا بقطع قناة البيض والمبيض بالمقص ، ثم قم باستئصال قناة البيض من الرحم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig02.jpg"> الشكل 2: استرجاع الزيجوت. يتم ثقب أمبولة تضخم قناة فالوب بالملقط لتحرير مجمع الركام والزيجوت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig03.jpg"> الشكل 3: عزل الزيجوت العاري مع هضم الهيالورونيداز. باستخدام الملقط ، انقل مركب الركام والزيجوت بعناية إلى محلول M2 يحتوي على 0.5 مجم / مل هيالورونيداز ، واتركه لبضع دقائق حتى تنفصل الخلايا الركامية عن الزيجوت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig04.jpg"> الشكل 4: زراعة جنين الفأر في المختبر . تحضير 12 قطرة صغيرة من وسط KSOM ، كل منها بحجم 20 ميكرولتر. قم بتغطية القطرات الدقيقة ب 3-5 مل من الزيت المعدني. نقل أجنة الفئران من وسط M2 إلى النصف العلوي من قطرات KSOM الدقيقة لغسلها جيدا ، ووضع الأجنة المغسولة في النصف السفلي ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 4 أيام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig05.jpg"> الشكل 5: زرع الجنين. ضع برفق 5-15 كيسا أريميا طازجا في كل بئر من الصفيحة المكونة من 12 بئرا والتي تحتوي على خلايا إيشيكاوا للاستزراع المشترك. بعد 48 ساعة حضانة ، حرك اللوحة بسرعة 3x. ستظهر الأجنة غير المرتبطة حركة عائمة أو متدحرجة على سطح خلايا إيشيكاوا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig06.jpg"> الشكل 6: تأثير الإستروجين فائق التركيز على معدل انغراس الجنين. تشير العلامة النجمية إلى اختلاف ذو دلالة إحصائية ، P &lt; 0.05. الاختصارات: E2 = استراديول ؛ P4 = البروجسترون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

يصف هذا البروتوكول منهجيات إنشاء نموذج بسيط وفعال لزرع الجنين في المختبر لتقييم الجزيئات ذات الصلة التي تؤثر على عملية زرع الجنين.

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic ...

establishment-of-an-embryo-implantation-model-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، نصف زرع الخلايا السرطانية على غشاء المشيمة للدجاج لتوليد نموذج في البيضا. نجح النموذج في تطعيم خلايا سرطان المبيض لدراسة تطور سرطان أمراض النساء.

نمذجة السرطان القائمة على غشاء المشيمة الدجاج: نموذج داخل البيض لدراسة تكوين أورام الخلايا السرطانية والورم الخبيث

ويصف هذه المخطوطة في المختبر ovule زراعة أسلوب يتيح تصوير خلية يعيش نبات زيجوتيس والأجنة. ويستخدم هذا الأسلوب لتصور ديناميات داخل الخلايا أثناء الاستقطاب الزيجوت وتحديد مصير الخلية في وضع الأجنة.

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

وتجري تقييمات مستمرة لتقنيات الإنجاب المساعدة (الفنون) لتحسين النتائج والحد من المخاطر المرتبطة بها. تصف هذه المخطوطة اجراء لنقل الاجنه بالحد الأدنى من التوغل مع بروتوكول فعال للحجز بالتبريد يسمح باستخدام الأرانب كنموذج حيواني مثالي لتكاثر البشر.

نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب

الخزعة الكيسية الكيسية والتزجيج مطلوبان لإجراء اختبارات جينية قبل الزرع بكفاءة. نهج ينطوي على فتح تسلسلي للpellucida المنطقة واسترجاع 7-8 خلايا التروبسيتوديرم في اليوم 5-7 بعد التلقيح يحد من كل من عدد التلاعبات المطلوبة والتعرض للجنين لظروف بيئية دون الأمثل.

خزعة الكيسة الكيسية البشرية والتزجيج

نقدم نموذج غشاء chorioallantoic الدجاج كبديل، قابل للزرع، في نموذج الجسم الحي لتطعيم خطوط خلايا سرطان النساء والمسالك البولية والأورام المشتقة من المريض.

استخدام غشاء Chorioallantoic الدجاج في نموذج Vivo لدراسة أمراض النساء وسرطان المسالك البولية

هنا ، نحن وصف طريقة للاحترار البلاستوسيستات البشرية vitrified ، وزراعة لهم من خلال فترة زرع في المختبر ، وهضمها في خلايا واحدة وجمع الخلايا الأرومية في وقت مبكر لمزيد من التحقيق.

مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية

تسمح المنصة المحسنة لزراعة الأجنة بأكملها بالتطور المستمر والقوي خارج الرحم لأجنة الفئران بعد الزرع لمدة تصل إلى ستة أيام ، من مراحل ما قبل المعدة حتى التكوين العضوي المتقدم. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل الإجراء القياسي لزراعة الأجنة الناجحة باستخدام لوحات ثابتة وأنظمة زجاجات دوارة.

خارج الرحم زراعة أجنة الفئران من ما قبل المعدة إلى التكوين العضوي المتقدم

يظهر البروتوكول نموذجا تجريبيا جديدا في المختبر يمكنه تلخيص بيولوجيا نوعين من خطوط الخلايا الملتصقة بسقالة مطبوعة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). يتم وصف بناء هذا النموذج وإجراءات التشغيل ، من تحضير الخلايا وزراعة الخلايا إلى التحليل والتقييم.

نموذج الزراعة المشتركة باستخدام نوعين من خطوط الخلايا الملتصقة

يصف هذا البروتوكول إجراءات النضج المختبري لبويضات الفئران، والتلقيح الصناعي ، والزراعة الجنينية اللاحقة حتى مرحلة الكيسة الأريمية.

نضج بويضات الفأر في المختبر، والتخصيب، وزراعة الأجنة قبل الانغراس

كريستوفر CW هيوز يصف فائدة نظام ثقافته لدراسة الأوعية الدموية في المختبر. وهو ما يفسر أهمية الليفية التي تفرز حرجة ، مجهولة الهوية حتى الآن ، والتي تسمح للعامل ذوبان الخلايا البطانية لتشكيل ثقافة السفن في ذلك الفرع ، وشكل مناسبة لومينز ، والخضوع anastamosis.

كريستوفر هيوز : حدث في نموذج المختبر لدراسة الأوعية الدموية (مقابلة)

اكتشف نموذج زرع الجنين في المختبر لدراسة التفاعلات بين الجنين والبطانة الرحمية. يُظهر البحث تأثيرات الهرمونات على معدلات الزرع ويقدم استراتيجيات لتحسين نتائج التلقيح الصناعي.

إنشاء نموذج زرع الجنين في المختبر

استكشف المزيد من الفيديوهات