Name: عزل خلايا الدم البشرية الطرفية أحادية النواة من معاطف بافي عبر فصل حبة مغناطيسية مناعية عالية الإنتاجية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: تعلم عزل خلايا الدم البيضاء PBMCs من الدم المحيطي باستخدام الفصل المغناطيسي الآلي عالي الإنتاجية. تضمن هذه الطريقة حيوية الخلايا فوق 90% وتقلل جهد الفنيين مع زيادة تنوع العينات للبحوث المستقبلية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يعترف البنك الحيوي الصحي على مستوى الولاية في نيو ساوث ويلز بامتنان بالدعم المقدم من علم الأمراض الصحية في نيو ساوث ويلز ، ومكتب نيو ساوث ويلز للبحوث الصحية والطبية ، ومنطقة سيدني الصحية المحلية. بالإضافة إلى ذلك ، يعترف المؤلفون بامتنان ب Omico والدراسات البحثية الأخرى التي يدعمها البنك الحيوي على مستوى الولاية في نيو ساوث ويلز لمنح الإذن بنشر البيانات التي تم إنشاؤها داخليا واستخدام العينات غير المستخدمة لأغراض البحث. يشكر المؤلفون البروفيسور جينيفر براين (علم الأمراض الصحية في نيو ساوث ويلز ، جامعة سيدني) على القيادة والمناقشات النقدية. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

تم الحصول على عينات الدم لمراقبة الجودة والبيانات التي تم إنشاؤها داخليا (مثل عدد الخلايا وصلاحيتها وعمر العينة عند المعالجة) من الدراسات البحثية المتفق عليها في البنك الحيوي على مستوى الولاية في نيو ساوث ويلز ، مستشفى الأمير ألفريد الملكي (موافقة HREC: 2019/ETH06776). تم جمع عينات الدم البشري للبالغين المعالجة (أي المستنفدة للبلازما) وغير المفحوصة وغير المحددة في أنابيب EDTA. تمت معالجة عينات الدم لمراقبة الجودة هذه بعد أقل من 72 ساعة من جمعها واستخدمت في تجارب عزل PBMC التي تقارن تدرج الكثافة والطرق القائمة على الخرز. للحصول على طريقة فصل تدرج الكثافة المستخدمة في النتائج التمثيلية، راجع الإجراء في الملف التكميلي 1. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة لهذه الدراسة في جدول المواد.
1. تحضير الدم الكامل
<ol><li>اقلب بلطف 10 مل من أنابيب الدم الكاملة (المغلفة بحمض الإيثيلين ديامينيترايتيك [EDTA] أو حمض سترات الدكستروز [ACD] أو هيبارين الليثيوم) 10 مرات في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>اختياري: إذا كان سيتم تخزين الدم الكامل ، فقم بقسمة في أنابيب التبريد لتخزين -80 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بطرد الأنابيب باستخدام دوار دلو متأرجح عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند 22 درجة مئوية مع تشغيل الفرامل (9 تسارع / 9 تباطؤ).</li>
</ol>2. مجموعة معطف بافي
<ol><li>بعد الطرد المركزي ، ضع العينات في خزانة السلامة البيولوجية وتحقق من الطبقات الثلاث المتميزة (كما هو موضح في الشكل 1). ملاحظة: توجد كرات الدم الحمراء في الطبقة الحمراء الداكنة السفلية لأنبوب الطرد المركزي. توجد طبقة بيضاء غير شفافة تحتوي على خلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية فوق طبقة كرات الدم الحمراء ، والمعروفة باسم معطف بافي. الطبقة الصفراء العليا تحتوي على البلازما.</li>
	<li>اختياري: إذا كان سيتم تخزين البلازما ، فقم ببلازما القسمة في أنابيب التبريد لتخزين -80 درجة مئوية.</li>
	<li>ماصة 1 مل من معطف بافي (مادة أولية) من أنبوب دم سعة 10 مل ونقلها إلى الأنبوب المحدد والملصق في الخطوة 3.1 والخطوة 4.1 للطرق اليدوية والآلية ، على التوالي. قم بتدوير المعطف المكفوف (طبقة بيضاء غير شفافة) باستخدام طرف الماصة واجمع المعطف المنتفخ عن طريق الشفط. ملاحظة: أقل من 100 ميكرولتر من البلازما وكرات الدم الحمراء مقبولة أثناء الشفط. إذا تم جمع أنابيب دم متعددة لمشارك واحد ، يمكن تجميع المعاطف المنتفخة. ومع ذلك ، قد يؤثر هذا على تركيز الصفائح الدموية13.</li>
	<li>للمعالجة اليدوية ، انتقل إلى القسم 3. للمعالجة الآلية ، انتقل إلى القسم 4.</li>
	<li>اختياري: إذا كان سيتم تخزين كرات الدم الحمراء ، فقم بقسمة كرات الدم الحمراء في أنابيب التبريد لتخزين -80 درجة مئوية.</li>
</ol>3. تنقية PBMC - الطريقة اليدوية
ملاحظة: يمكن معالجة ما يصل إلى 8 عينات لكل حامل مغناطيس بواسطة مشغل واحد.
<ol><li>قم بتسمية 3 × 5 مل من أنابيب البوليسترين بأحرف A-C. ملاحظة: استخدم الترقيم التسلسلي في حالة إجراء أكثر من عينة واحدة ، أي 1A و 1B و 1C و 2A و 2B و 2C.</li>
	<li>أضف 60 ميكرولتر من 0.1 M EDTA (لتركيز EDTA النهائي البالغ 6 mM ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، انظر الملف التكميلي 2 للوصفة) إلى الأنبوب A الذي يحتوي على معطف بافي المنقول في الخطوة 2.3.</li>
	<li>أضف 50 ميكرولتر من أنبوب مزيج الكوكتيل (انظر جدول المواد) إلى الأنبوب A ، واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل ، واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أضف 890 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب A واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل.</li>
	<li>دوامة أنبوب حبة مغناطيسية (انظر جدول المواد) لمدة 30 ثانية.</li>
	<li>أضف 50 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية إلى الأنبوب A واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل.</li>
	<li>ضع الأنبوب A على الفور في حامل المغناطيس واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بسحب تعليق الخلية المخصب بعناية في الأنبوب B ، وجمع الكسر الشفاف مع عدم وجود / الحد الأدنى (<100 ميكرولتر) كرات الدم الحمراء لاستعادة PBMC الأمثل. ملاحظة: لا تزعج الخرزات المرتبطة بالمغناطيس. يوصى باستخدام ماصة النقل.</li>
	<li>قم بإزالة الأنبوب A من حامل المغناطيس وتخلص منه.</li>
	<li>أضف حبات مغناطيسية سعة 50 ميكرولتر إلى تعليق الخلية في الأنبوب B واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل.</li>
	<li>ضع الأنبوب B على الفور في حامل المغناطيس واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>ماصة بعناية تعليق الخلية المخصب في الأنبوب C ، وجمع فقط الجزء الواضح. ملاحظة: لا تزعج الخرزات المرتبطة بالمغناطيس. يوصى باستخدام ماصة النقل.</li>
	<li>أخرج الأنبوب B من حامل المغناطيس وتخلص منه.</li>
	<li>ضع الأنبوب C على الفور في حامل المغناطيس واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>ماصة بعناية تعليق الخلية المخصب في أنبوب الطرد المركزي المسمى وأعلى ما يصل إلى 2 مل مع PBS.</li>
	<li>انقل 50 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كوب عينة من عداد الخلية الآلي. للحصول على عدد خلايا تخفيف 1:10 ، أضف 450 ميكرولتر من PBS. انتقل إلى القسم 5 لمعرفة خطوات عد الخلايا.</li>
</ol>4. تنقية PBMC - الطريقة الآلية
ملاحظة: يمكن معالجة ما يصل إلى 4 عينات بواسطة أداة PBMC آلية واحدة. يمكن تشغيل أدوات متعددة بالتوازي بواسطة مشغل واحد.
<ol><li>تسمية 2 × 14 مل أنابيب مع الحرفين A و B ، 1 × 50 مل أنبوب الطرد المركزي مع الحرف C ، و 1 × 50 مل أنبوب الطرد المركزي مع "النفايات". ملاحظة: مطلوب حاوية نفايات واحدة فقط لكل تشغيل على أداة PBMC الآلية. استخدم الترقيم التسلسلي في حالة إجراء أكثر من عينة واحدة ، أي 1A و 1B و 1C و 2A و 2B و 2C.</li>
	<li>أضف 60 ميكرولتر من 0.1 M EDTA (لتركيز EDTA النهائي 6 mM) إلى الأنبوب A الذي يحتوي على طبقة buffy المنقولة في الخطوة 2.3.</li>
	<li>دوامة أنبوب الخرزة المغناطيسية (انظر جدول المواد)  لمدة 30 ثانية.</li>
	<li>قم بتشغيل أداة PBMC الآلية عن طريق تشغيل الطاقة في مقدمة الجهاز.</li>
	<li>على الشاشة الرئيسية لأداة PBMC الآلية ، حدد ملف التعريف وحدد البروتوكول المطلوب. ملاحظة: EasySep عزل PBMC البشري المباشر 19654 - كان Buffy Coat هو ملف تعريف البروتوكول المحدد لعزل PBMC هذا. راجع الإجراء القياسي للمصنع لهذا الملف الشخصي في تقرير البروتوكول14.</li>
	<li>أدخل حجم البداية (كمية معطف بافي المستنشق في الأنبوب A) ، وكرر لكل عينة.</li>
	<li>حدد جميع الأرباع التي ستستخدم نفس مجموعة الكاشف. ملاحظة: إذا تم استخدام نفس البروتوكول لأكثر من ربع واحد ، فسيقترح جهاز PBMC الآلي استخدام نفس مجموعة الكاشف لجميع الأرباع14.</li>
	<li>قم بتحميل دائري الجهاز بالمواد الاستهلاكية المصنفة وأطراف التصفية والحاوية العازلة. يجب تحميل مجموعة الكاشف التي تحتوي على أنبوب الخرزة المغناطيسية وأنبوب مزيج الكوكتيل في الربع 1. ملاحظة: ستسأل الأداة عما إذا كان المستخدم يرغب في استخدام مجموعة كاشف 1 لجميع الأرباع. حدد "نعم" وقم بتمييز جميع الأرباع باستخدام مجموعة الكاشف.</li>
	<li>بمجرد اكتمال التحميل ، قم بإزالة الأغطية من المواد الاستهلاكية والكواشف وحدد تشغيل على شاشة الجهاز.</li>
	<li>عند اكتمال التشغيل ، حدد تفريغ وإزالة العينات (التي تحتوي على تعليق PBMC المسمى في الأنبوب C) من دائري الجهاز. قم بتخزين أنبوب الخرزة المغناطيسية وأنبوب مزيج الكوكتيل والحاوية العازلة عند 4 درجات مئوية. تجاهل الأنابيب المصنفة على أنها A و B والنفايات (انظر الخطوة 4.1) ونصائح التصفية. ملاحظة: لا يلزم زيادة رصيد PBS للطريقة الآلية ، حيث ينتج تعليق PBMC حجما نهائيا يبلغ 7 مل.</li>
	<li>انقل 500 ميكرولتر من الخلايا إلى كوب عينة لعدد الخلايا بدون تخفيف. انتقل إلى القسم 5 لحساب الخلايا.</li>
</ol>5. عد الخلايا
<ol><li>قم بإجراء عد الخلايا وصلاحيتها باستخدام طريقة استبعاد صبغة التريبان الزرقاء باتباع تعليمات الشركة المصنعة15. ملاحظة: بالنسبة للعمليات الداخلية للمؤلف ، يتم إجراء تحليل الخلية باستخدام عداد خلية آلي مع الإعدادات التالية للحصول على PBMCs. عامل التخفيف = 10 (للبروتوكول اليدوي ، إذا كان تعليق الخلية بحجم منخفض) أو 1 (للبروتوكول الآلي) نوع الخلية: PBMC نطاق التركيز = 5 × 104 إلى 1 × 107 خلايا / مل نطاق الحجم (القطر) = 8 ميكرومتر إلى 50 ميكرومتر عدد الصور = 50</li>
</ol>6. إعداد الحفظ بالتبريد
<ol><li>أجهزة الطرد المركزي (باستخدام دوار دلو متأرجح) أنابيب العينة عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 22 درجة مئوية مع تشغيل الفرامل (9 تسارع / 9 تباطؤ).</li>
	<li>بعد الطرد المركزي ، ضع العينات مرة أخرى في خزانة السلامة البيولوجية.</li>
	<li>باستخدام ماصة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية. يمكن ترك كمية صغيرة من المادة الطافية مع حبيبات PBMC لضمان عدم إزعاجها.</li>
	<li>أعد تعليق الحبيبات في 3 مل من وسط الحفظ بالتبريد البارد. امزج التعليق ببطء ورفق لأعلى ولأسفل حتى يصبح متجانسا. ملاحظة: يمكن تعديل حجم وسط الحفظ الخلوي بناء على تركيز PBMC النهائي المطلوب.</li>
	<li>قم بتوزيع 1 مل من PBMC المعاد تعليقه في أنبوب تبريد مخصص مسبقا وضعه داخل حاوية تجميد معدل التحكم لمدة لا تقل عن 4 ساعات عند -80 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن تعديل حجم PBMCs المقتبسة لكل أنبوب تبريد بناء على تفضيل الباحث.</li>
	<li>بعد تخزين أنابيب التبريد عند -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات ، انقل أنابيب التبريد إلى خزان طور بخار النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.</li>
</ol>7. تحليل البيانات الإحصائية
<ol><li>تم تحليل بيانات النتائج التمثيلية باستخدام البرامج الإحصائية والرسوم البيانية كما هو محدد في الملف التكميلي 3.</li>
</ol>

عزل PBMC عالي الإنتاجية باستخدام حبات مغناطيسية مناعية

<ol><li>Alexovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+A+review+of+recent+proteomic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications.</a> Proteomics. 22 (15-16), e2200026(2022).</li>
<li>Zhang, M., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multi-differentiation+potential+of+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48(2012).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).</li>
<li>Kleeberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+recovery+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+cryopreserved+for+up+to+12+years+in+a+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).</li>
<li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+%28PBMC%29+by+density+gradient+centrifugation+on+percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li>
<li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).</li>
<li>Gautam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+gene+expression+profiles+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+multiple+collection+and+processing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods.</a> PLoS One. 14 (12), e0225137(2019).</li>
<li>Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+validation+for+automated+isolation+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells.</a> Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).</li>
<li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+biobanking+using+a+robotized+liquid+handling+workstation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation.</a> J Transl Med. 17 (1), 371(2019).</li>
<li> Stemcell Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vol.+27156%5BTitle%5D)+AND+%22STEMCELL+TECHNOLOGIES%22%5BJournal%5D)">Vol. 27156.</a> STEMCELL TECHNOLOGIES. , 1-4 (2020).</li>
<li>Hornschuh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+magnetic+sorting+preserves+the+functionality+of+ex+vivo+cultivated+non-adherent+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes.</a> Biology (Basel). 11 (11), 1583(2022).</li>
<li>Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+isolated+by+positive+and+negative+magnetic+sorting+techniques+show+different+molecular+characteristics+and+immunophenotypic+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour.</a> F1000Res. 6, 2045(2017).</li>
<li>Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+processing+for+pathogen+inactivation+of+double-dose+buffy-coat+platelet+concentrates%3A+Maintained+in+vitro+quality+over+7-day+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage.</a> Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).</li>
<li>Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Stemcell Technologies. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html">https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html</a> (2022).</li>
<li>Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use. Beckman Coulter. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf">https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf</a> (2017).</li>
<li>Fuchs, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+biobanking%3A+Employing+a+robotic+system+for+automated+mononuclear+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation.</a> Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).</li>
<li>Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology%2C+white+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls+Publishing%22%5BJournal%5D)">Histology, white blood cell.</a> StatPearls Publishing. , (2024).</li>
<li>Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+buffy+coat+extract+on%3A+Methodology%2C+feasibility%2C+optimization%2C+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study.</a> Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).</li>
<li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield%2C+but+severly+compromise+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li>
<li>Yi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+delayed+PBMC+processing+on+functional+and+genomic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays.</a> J Immunol Methods. 519, 113514(2023).</li>
<li>Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+processing+of+blood+increases+the+frequency+of+activated+CD11b%2B+CD15%2B+granulocytes+which+inhibit+t-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function.</a> J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+t-cell+responses%3A+Position+statement+of+the+t-cell+workshop+committee+of+the+immunology+of+diabetes+society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society.</a> Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).</li>
<li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+%28PBMC%29+functional+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).</li>
</ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

PBMCs البشرية هي أنواع خلايا متعددة الاستخدامات تستخدم في العديد من المقايسات. ومع ذلك ، غالبا ما يكون معدل إنتاجية العزل قيدا في العديد من المختبرات ، بما في ذلك Biobanks16. في السابق ، قام البنك الحيوي على مستوى الولاية الصحية في نيو ساوث ويلز بعزل PBMCs باستخدام طريقة تدرج الكثافة. تم التحقيق في الأتمتة لطريقة فصل تدرج الكثافة لزيادة قدرة المعالجة ، ولكن تم تحديد العوائق التي تحول دون التنفيذ ، بما في ذلك (i) تكلفة معالج السوائل مع وحدة الطرد المركزي لتكون مؤتمتة بالكامل ، مع المتطلبات الإضافية لوحدة HEPA لإنتاج منتج معقم ، (ii) موظفين مدربين على البرمجة ، و (iii) الوقت اللازم لاختبار البروتوكول. لذلك ، استكشفت هذه الدراسة طرقا بديلة وحددت مجموعة PBMC البشرية التي تم الحصول عليها تجاريا والتي يمكن استخدامها للمعالجة اليدوية والآلية. يتم ضمان العقم لأن المعدات المطلوبة للمعالجة تتناسب مع خزانة السلامة البيولوجية القياسية (بطول 1.2 متر). تفصل هذه الورقة التعديلات التي تم إجراؤها على البروتوكول14 الموصى به من قبل الشركة المصنعة ، لزيادة الكفاءة وخفض تكاليف الكاشف دون التضحية بالجودة. بالإضافة إلى ذلك ، تم توسيع بروتوكول الشركة المصنعة لتفصيل خطوات عينات البنك الحيوي للبحث المستقبلي ، بما في ذلك الدم الكامل (الخطوة 1.2) ، والبلازما (الخطوة 2.2) ، و RBC (الخطوة 2.5) من أنبوب الدم الأصلي ، وكذلك عد الخلايا والحفظ بالتبريد.
في هذه الدراسة ، تمت مقارنة ثلاثة بروتوكولات عزل PBMC: فصل تدرج الكثافة ، والعزل اليدوي ، والآلي القائم على الخرز. تم إجراء تعديلات على بروتوكول الشركة المصنعة اليدوي القائم على الخرز ، بما في ذلك إزالة تخفيف معطف بافي قبل عزل PBMC ، وإلغاء متطلبات انقطاع التيار الكهربائي لأجهزة الطرد المركزي ، مما يسمح للمحققين باتباع بروتوكول عزل PBMC قابل للتكيف وفعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية. أولا ، تم استخدام ثماني عينات دم كاملة متطابقة لعزل PBMCs لمقارنة فصل تدرج الكثافة والتقنية اليدوية القائمة على الخرز. الأهم من ذلك ، أن توزيعات مجموعات الخلايا ، وصلاحية الخلية ، واستعادة PBMCs لم تكن مختلفة بشكل كبير بين الطريقتين المقارنتين ، كما هو موضح في الشكل 2A-F ، والشكل 3A ، والشكل التكميلي 1 ، على التوالي. في البيانات التمثيلية ، كان عدد الخلايا أعلى لطريقة فصل تدرج الكثافة باستخدام طريقة استبعاد تريبان الأزرق ولكن ليس عند استخدام محلل خلايا أمراض الدم. استخدمت إعدادات نوع خلية PBMC على عداد الخلية نطاق قطر الخلية من 8-50 ميكرومتر ، وبالتالي ، ستشمل الأعداد PBMCs وكذلك الخلايا المحببة (قطرها حوالي 12-15 ميكرومتر) عند استخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق17. في حين أن عداد الخلايا الدموية قدم خصوصية أعلى من طريقة استبعاد التريبان الأزرق ، كانت بعض حسابات الاسترداد أعلى من 100٪ ، مما يعكس هامش الخطأ في الأداة (انظر الشكل التكميلي 1). لذلك ، يوصى بأن يطبق الباحثون مجموعة من تقنيات عد الخلايا عند مقارنة العوائد من بروتوكولات عزل PBMC ، لأن معظم التقنيات لا تقدم كلا من تعداد الخلايا التفاضلية المحددة والحساسة للغاية. علاوة على ذلك ، لم يتم إجراء المقايسات لمقارنة النشاط الوظيفي ل PBMCs الناتجة عن أي من التقنيتين ، وهو قيد على تحليلنا.
بعد ذلك ، تمت مقارنة الطرق اليدوية والآلية القائمة على الخرز ، ولم يتم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية بين إنتاجية PBMC أو صلاحيتها من 8 عينات متطابقة (الشكل 4 أ ، ب). لم تتم مقارنة مجموعات الخلايا بشكل فردي ، حيث تم استخدام نفس كوكتيل عزل الأجسام المضادة لكلتا الطريقتين. الأهم من ذلك ، تم تقليل الوقت العملي لمعالجة 8 عينات من 43 دقيقة إلى 22 دقيقة باستخدام البروتوكول الآلي (الشكل 4C). في حين يتم ضمان الإنتاجية ، والوقاية من إرهاق الفني ، واتساق معالجة العينات باستخدام الأتمتة ، فإن تكلفة الكواشف والمواد الاستهلاكية أعلى بكثير عند 3-4 أضعاف أكثر من الطريقة اليدوية القائمة على الخرز. هذا بعد إجراء تعديلات على بروتوكول التصنيع لاستخدام 1 مل من معطف بافي (من حجم دم كامل يبلغ 10 مل) بدلا من النطاق الموصى به من 2-5 مل (من حجم دم كامل يبلغ 10 مل و / أو أكثر). إذا كانت الميزانية قيدا ، فإن اختيار الطريقة اليدوية يمكن أن يقلل من وقت المعالجة بنسبة ~ 25٪ مع الحفاظ على تكاليف الكاشف والتكاليف الاستهلاكية المماثلة لتلك الخاصة بطريقة فصل الكثافة. يوصى بمعالجة ما لا يزيد عن 8 عينات في المرة الواحدة لكل فني لضمان تداخل العينات بشكل كاف (~ 30 ثانية / عينة) خلال فترات الحضانة البالغة 5 دقائق (الخطوات 3.7 و 3.11 و 3.14).
في كل من الطرق اليدوية والآلية القائمة على الخرز ، تعد إزالة معطف بافي خطوة حاسمة لضمان عزل PBMC الأمثل. من المهم ملاحظة أنه يتم استخدام معطف بافي بدلا من الدم الكامل في هذا البروتوكول حيث يعتمد حجم الكواشف على أحجام المواد الأولية10. يمكن أن تكون إزالة حجم معطف بافي بالكامل بشكل فعال تحديا تقنيا. في البداية ، قامت هذه الطريقة بإزالة 0.5 مل من معطف بافي ، ولكن تم زيادته إلى 1 مل لتحسين التعافي. لضمان التعافي الكافي والمتسق لمعطف بافي ، فإن تفصيل هذه العملية مهم في توثيق البروتوكول والتدريب. يوصى بتدوير طرف ماصة أثناء شفط معطف بافي مع الحرص على عدم استنشاق الكثير من كرات الدم الحمراء من الطبقة أدناه (الخطوة 2.3). من المهم عدم تشبع كوكتيل الأجسام المضادة الذي يربط الخلايا غير المرغوب فيها (أي الخلايا المحببة وخلايا الدم الحمراء) ، والتي يمكن أن تؤثر على المحصول والنقاء10. لتقليل كرات الدم الحمراء التي تم جمعها أثناء استخراج معطف بافي ، يجب أن يكون طرف الماصة بين طبقة معطف البلازما وطبقة معطف بافي. يمكن زيادة حجم معطف بافي من 1 مل ؛ ومع ذلك ، يجب توخي الحذر كما هو موضح أعلاه للتأكد من أن ما لا يزيد عن 10٪ من الحجم الذي تم جمعه يحتوي على كرات الدم الحمراء. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام معالج سائل آلي لجمع معاطف بافي باستمرار18. ومع ذلك ، فإن الساعات المخصصة المطلوبة لمعايرة بروتوكولات أدوات مناولة السوائل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، خاصة بالنظر إلى النفقات ، قد لا تكون مجدية لمعظم المختبرات.
كان انتقال وتطبيق البروتوكول القائم على حبة الأتمتة أمرا ضروريا نظرا لهدف البنك الحيوي على مستوى الولاية في نيو ساوث ويلز لمعالجة 23000 PBMCs على مدار سنوات 3 القادمة. هنا ، تم إثبات أنه يمكن عزل PBMCs من أنابيب ACD حتى 9 أيام من التجميع بمتوسط جدوى >70٪. في حين أن الغلة كانت مثالية بعد 24 ساعة من التجميع ، فإن المعالجة ضمن هذا الإطار الزمني ليست ممكنة دائما حيث قد يلزم نقل العينات. وقد تبين أن PBMCs المعزولة إما بالطريقة اليدوية أو الآلية القائمة على الخرز قد يكون لها غلة >3 × 105 خلايا / مل دم كامل عند عزلها في غضون 4 أيام من الجمع و >1 × 105 خلايا / مل دم كامل عند عزلها في غضون 10 أيام من جمعها. ويلاحظ انخفاض أعداد العينات التي تزيد عن 5 أيام كقيد على هذا التحليل. علاوة على ذلك ، لم يتم فصل البيانات بناء على أعمار المشاركين وجنسهم والتاريخ السريري ، حيث لم يتم توفير هذه المعلومات. على الرغم من الحاجة إلى تحليل مقارن لفحص آثار التأخير في أوقات المعالجة لكلتا الطريقتين ، فقد تم الإبلاغ سابقا عن أن التأخير في عزل PBMC باستخدام طريقة تدرج الكثافة يقلل من جودة الخلية ويزيد بشكل كبير من تلوث كرات الدم الحمراء 19,20. بالإضافة إلى ذلك ، تزداد نسب المحببات إذا تأخرت المعالجة ، وبالتالي ، يجب تجميع العينات ذات "الأعمار" المتشابهة للتحليلات النهائية20،21،22. وتجدر الإشارة إلى أن هذه التجربة أجريت باستخدام مضادات تخثر الدم مع سكر العنب الحمضي (أي سترات الصوديوم وحامض الستريك وسكر العنب). ومع ذلك ، قد يختلف العائد و / أو نسبة أنواع الخلايا إذا تم استخدام مضادات التخثر الأخرى23 ؛ لذلك ينصح الباحثون باختيار مضاد تخثر مناسب بناء على تحليلات PBMC المقصودة.
باختصار ، تم تفصيل بروتوكول لعزل PBMC باستخدام حبات مغناطيسية قابلة للتكيف مع سير العمل عالي الإنتاجية لتلبية متطلبات القياس دون المساس بصلاحية الخلية. يمكن تحسين كل من الطرق اليدوية والآلية لإنتاج تركيزات معينة للخلايا عن طريق تغيير أحجام البدء وإعادة التعليق. انتقل البنك الحيوي على مستوى ولاية نيو ساوث ويلز للصحة من استخراج ~ 60 PBMCs شهريا باستخدام تقنية فصل تدرج الكثافة التقليدية إلى ~ 300 PBMCs شهريا باستخدام هذه الطريقة القائمة على الخرز المتوافقة مع الأتمتة. الهدف التالي للمؤلفين هو استخدام المنصة الآلية لمعالجة ما يصل إلى 1200 PBMCs شهريا ومقارنة PBMCs المعزولة بواسطة كل من تقنيات الحبيبات المغناطيسية (اليدوية والآلية) وتدرج الكثافة لتوجيه تنفيذ هذه التقنية إلى مختبرات أخرى مع التركيز بشكل خاص على البنوك الحيوية.

عزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMC) هي تقنية تفصل وتعزل الخلايا الليمفاوية والوحيدات عن مكونات الدم الكاملة الأخرى. PBMCs هي نوع من الخلايا متعددة الاستخدامات تستخدم في العديد من التطبيقات بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، العلاج المناعي ، وتطوير اللقاح ، وتحديد الهدف أو العلامات الحيوية ، وتطوير الأدوية ذات الأجسام المضادة / الجزيئاتالصغيرة 1,2. يمكن عزل هذه الخلايا عن الأفراد الأصحاء أو المرضى ويمكن استخدامها على الفور في عمليات المصب أو حفظها بالتبريد للبحث المستقبلي3. في بعض الحالات ، يكون الغرض النهائي معروفا ، بينما في حالات أخرى ، كما هو شائع في البنوك الحيوية ، يتم عزل PBMCs وتخزينها لتطبيقات مستقبلية غير محددة4.
الطرد المركزي المتدرج الكثافة هو التقنية التقليدية لعزل PBMCs5،6،7 من الدم الكامل ، باستخدام الفصل التفاضلي لأنواع الخلايا المكونة بناء على كثافة الخلية أثناء الطرد المركزي. في حين أنه قد يكون هناك بعض الاختلاف في هذه الطريقة ، يتم تخفيف الدم الكامل بشكل عام باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ويتم وضعه فوق وسط تدرج الكثافة في أنبوب طرد مركزي متخصص أو قياسي ، ثم يتم غزله. ينتج عن ذلك أربع طبقات متميزة: طبقة البلازما العلوية غنية بالصفائح الدموية ، وطبقة PBMC رقيقة فوق وسط تدرج الكثافة ، وأخيرا ، تتكون الطبقة السفلية من خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) والخلايا المحببة. على الرغم من أن هذه الطريقة قد أطلق عليها سابقا اسم "المعيار الذهبي"8 ، إلا أن هناك قيودا على التوسع ، مثل وقت المعالجة الطويل ، وقدرة أجهزة الطرد المركزي ، وصعوبة اقتباس منتجات الدم الأخرى (مثل البلازما وكرات الدم الحمراء) ، وكونها شاقة للأتمتة. في حين أن الأتمتة ممكنة لهذه الطريقة9 ، إلا أنها تتطلب برمجة شاملة لمعالج سائل (مع وحدة طرد مركزي لتكون مؤتمتة بالكامل) وستظل عملية طويلة.
من الآن فصاعدا ، يتم تقديم سير عمل بديل يستخدم فصل الخرزة المغناطيسية المناعية إما بمغناطيس ثمانية حاملات للمعالجة اليدوية أو أداة للمعالجة المؤتمتة بالكامل. تستخدم هذه الطريقة كوكتيل الأجسام المضادة الذي يضاف إلى الخلايا ويربط مجموعات الخلايا غير المرغوب فيها ، في هذه الحالة ، الصفائح الدموية والخلايا المحببة وكرات الدم الحمراء. تتم إزالة هذه المجموعات غير المرغوب فيها لاحقا عن طريق الفصل المغناطيسي ، تاركة مجموعات الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية في الجزء السالب الجاهز للمعالجةالنهائية 10. طريقة الانتقاء السلبي هذه أسرع من طرق الانتقاء الإيجابي التي تتطلب خطوات إضافية لإزالة الجسم المضاد ومركب الخرزة المغناطيسية من PBMCs. يعد الاختيار السلبي مفيدا أيضا حيث تم وصفه بأنه طريقة للحفاظ على وظائف الخلية11,12.

<table><tbody><tr><td>وسائط الحفظ بالتبريد الخلية CS10 ، 100 مل (CRYOSTOR)</td> <td>StemCell TM Technologies</td><td>07930</td><td></td></tr><tr><td>خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية</td><td>الحرارية Scientififc TM </td> <td>51033311</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell 1 مل FX</td><td>BioTools</td><td>BCS-407P</td><td>هذه هي حاوية التجميد بمعدل التحكم المستخدمة.</td></tr><tr><td>الماء المقطر&nbsp;</td><td>مختبرات باكتو</td><td>561832</td><td></td></tr><tr><td>DxH 500 محلل أمراض الدم&nbsp;</td>يشار <td>إلى Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B40601</td><td>باسم عداد الخلايا الآلي الخارجي.</td></tr><tr><td>EasyEightsTM EasySepTM Magnet</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>18103</td><td></td></tr><tr><td>EasySepTM طقم عزل PBMC البشري المباشر</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>19654 تتضمن مجموعة أدوات 19654</td><td>أنبوب الخرزة المغناطيسية وأنبوب مزيج الكوكتيل</td></tr><tr><td>حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك</td><td>سيجما-ألدريتش بي تي واي المحدودة</td><td>توجد تعليمات E6758-500G</td><td>لصنع محلول EDTA 0.1M من ملح EDTA في الملف التكميلي 2.</td></tr><tr><td>Lymphoprep TM كثافة التدرج</td><td>الخلية الجذعية المتوسطة TM Technologies</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge ST4 Plus الطرد المركزي</td><td>الحراري Scientififc TM </td> <td>THR75009903</td><td></td></tr><tr><td>Orion Star A211 مقياس الأس الهيدروجيني الكهربائي</td><td>Thermo Scientififc TM </td> <td>STARA2110</td><td></td></tr><tr><td>أوريون & تجارة; روس ألترا & تجارة; الصمام الثلاثي الزجاجي & التجارة ؛ أقطاب كهربائية مركبة من الأس الهيدروجيني / ATC</td><td>Thermo Scientififc < > TM </td> <td>8302 BNURCA</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، محلول ، 1X ، 500 مل</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoboSep TM Buffer 1X</td><td>StemCell TM Technologies</td><td>20104</td><td>Software المستخدمة ل التحليل الإحصائي.</td></tr><tr><td>RoboSepTM-S</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>21000</td> أداة <td>فاصل الخلايا المؤتمتة بالكامل.</td></tr><tr><td>RoboSep&trade; نصائح التصفية</td><td>StemCell TM Technologies</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>SepMate TM-50 (IVD) أنابيب</td><td>StemCell TM تقنيات</td><td>85460</td><td>IVD - التشخيص في المختبر. يعرف أيضا باسم SepMate TM -50 أنبوب</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR Cell Anlayzer</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td></td><td>عداد الخلايا الآلي الداخلي. الأداة قديمة ولم تعد متاحة للشراء (اعتبارا من 31 ديسمبر 2022). الأداة البديلة هي محلل قابلية الخلية ViCell BLU (رقم المنتج C19196).</td></tr><tr><td>طقم كاشف Vi-CELL XR رباعي العبوات</td><td>بيكمان كولتر لعلوم</td><td>الحياة 383722</td><td></td></tr></tbody></table>

عزل خلايا الدم البشرية الطرفية أحادية النواة من معاطف بافي عبر فصل حبة مغناطيسية مناعية عالية الإنتاجية

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation

خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية. تتمتع PBMCs المحفوظة بالتبريد بصلاحية مستقرة في التخزين طويل الأجل ، مما يجعلها نوعا مثاليا من الخلايا للعديد من أغراض البحث النهائية ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي والمقايسات المناعية وتسلسل الجينوم. عادة ، يتم عزل PBMCs عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة ، ومع ذلك ، فهو سير عمل منخفض الإنتاجية يصعب ومكلف توسيع نطاقه. تقدم هذه المقالة سير عمل عالي الإنتاجية باستخدام طريقة عزل PBMC المستندة إلى حبة مغناطيسية سريعة التنفيذ. تمت مقارنة التركيز الكلي للخلايا وصلاحيتها وتوزيعها مع PBMCs التي تم الحصول عليها باستخدام عزل تدرج الكثافة ، وكانت صلاحية الخلية ونسبة أنواع الخلايا قابلة للمقارنة لكلتا التقنيتين. أظهرت PBMCs المعزولة أكثر من 70٪ من الصلاحية حتى 9 أيام بعد جمع الدم ، على الرغم من انخفاض المحصول بمقدار النصف بعد 5 أيام مقارنة ب PBMCs التي تمت معالجتها في غضون 24 ساعة من جمعها. باختصار، توضح هذه المقالة بروتوكول PBMC الذي يستخدم نهجا قائما على الخرزة للتكيف مع سير عمل عالي الإنتاجية ويوضح أن كلا من الأساليب اليدوية والآلية المستندة إلى الخرز يمكن أن تزيد من قدرة المعالجة وتوفر المرونة للميزانيات المختلفة.

تم قياس نسب الخلايا الليمفاوية ، وحيدات ، العدلات ، الحمضات ، والخلايا القاعدية قبل (أي في الدم الكامل) وبعد عزل PBMC عندما تم عزل PBMCs باستخدام طريقة فصل التدرج القائم على الخرز أو الكثافة. تم إثراء نسب الخلايا الليمفاوية والوحيدات بشكل كبير بكلتا الطريقتين (الشكل 2 أ ، ب). بالإضافة إلى ذلك ، انخفضت نسب العدلات والحمضات والخلايا القاعدية (أي الخلايا المحببة) بشكل ملحوظ في PBMCs المعزولة بالطريقة القائمة على الخرز (الشكل 2C-F). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في نسب الخلايا الليمفاوية ، وحيدات الخلايا ، العدلات ، الحمضات ، الخلايا القاعدية ، والخلايا المحببة بين تدرج الكثافة والطرق القائمة على الخرز (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، تم حساب النسبة المئوية للاسترداد لأنواع الخلايا المذكورة أعلاه (انظر الشكل التكميلي 1). كان متوسط صلاحية الخلية أكثر من 95٪ لكلتا الطريقتين ، ولم تكن مختلفة بشكل كبير (الشكل 3 أ). تم حساب PBMCs أيضا باستخدام نطاق حجم (قطر) من 8 ميكرومتر إلى 50 ميكرومتر ، حيث أنتجت طريقة فصل تدرج الكثافة ما يقرب من ضعف إجمالي عدد الخلايا (الشكل 3 ب). 
بعد ذلك ، تمت مقارنة الطريقة الآلية القائمة على الخرز بالطريقة اليدوية. لم يتم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية لصلاحية الخلية (الشكل 4 أ) أو إجمالي عدد الخلايا (الشكل 4 ب) باستخدام الطريقة اليدوية أو الآلية. تمت مقارنة وقت معالجة هذه العينات ال 8 ، بما في ذلك وقت عدم التدخل الذي لا يتطلب أي تدخل بشري. كان إجمالي وقت المعالجة ل 8 عينات 43 دقيقة مقابل. 57 دقيقة للدليل مقابل الطريقة الآلية. تضمنت الطريقة الآلية 35 دقيقة من معالجة عدم التدخل (الشكل 4C).
تم تجريب سير العمل القائم على الخرزة لعزل PBMC (مع تسعير الدم الكامل والبلازما) على مدار 9 أشهر ، حيث تم عزل 1410 عينة PBMC من دم بشري غير مفحوص باستخدام المنصة اليدوية لأول 820 مشاركا ثم باستخدام الطريقة الآلية للمشاركين ال 590 التاليين. تم إجراء المعالجة إما في نفس اليوم أو حتى 10 أيام بعد التجميع وفقا لمعايير قبول الدراسة ، مع تأخير في المعالجة يرجع إلى حد كبير إلى أوقات عبور العينة. باستخدام الطريقة اليدوية أو الآلية ، كانت PBMCs التي تمت معالجتها في غضون 24 ساعة من المجموعة تتمتع بأعلى قابلية للتطبيق والاسترداد (الشكل 5). كان متوسط صلاحية الخلية &gt;90٪ ل PBMCs التي تمت معالجتها في غضون 5 أيام و &gt;70٪ ل PBMCs التي تمت معالجتها في غضون 10 أيام (الشكل 5 أ). انخفض متوسط غلة PBMC بنسبة 50٪ بعد 5 أيام مقارنة بالعينات المعالجة في غضون 24 ساعة (الشكل 5 ب).
<img alt="عملية عزل خلايا الدم والحفظ بالتبريد. أجهزة الطرد المركزي ، مخطط الخرز المغناطيسي ؛ تخزين الخلايا." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> الشكل 1: سير العمل التخطيطي لبروتوكول عزل PBMC القائم على الخرزة من معطف بافي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="مقارنة عزل خلايا الدم; الخلايا الليمفاوية ، الخلايا الوحيدة ، مخططات العدلات. تدرج الكثافة ، قائم على الخرز." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> الشكل 2: نسب الخلايا الليمفاوية ، وحيدات ، العدلات ، الحمضات ، الخلايا القاعدية ، والخلايا المحببة في الدم الكامل قبل وبعد عزل PBMC بتدرج الكثافة والطرق القائمة على الخرز. النسبة المئوية للخلايا الليمفاوية (A) ، وحيدات (B) ، العدلات (C) ، الحمضات (D) ، الخلايا القاعدية (E) ، والخلايا المحببة (F) في الدم الكامل المطابق قبل عزل PBMC (المربعات) وفي PBMCs بعد العزل عبر تدرج الكثافة (الدوائر المفتوحة) أو طريقة القائمة على الخرز (الدوائر المغلقة) (n = 8). ns = غير معنوي ، و * p &lt; 0.05 كما هو محدد بواسطة أحادي الاتجاه ANOVA (A و B) أو اختبار فريدمان (C- و). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="الرسم البياني لقابلية الخلية للبقاء والعد. تدرج الكثافة مقابل الخرز. التحليل الإحصائي للأساليب." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> الشكل 3: الصلاحية وعدد الخلايا الكلي ل PBMC المعزولة بواسطة تدرج الكثافة والطرق القائمة على الخرز. (أ) متوسط صلاحية الخلية (± SD) للعينات المعالجة باستخدام تدرج الكثافة (المربعات ، الشريط الداكن) مقابل الطرق القائمة على الخرز (الدوائر ، الشريط المفتوح) ل 8 عينات مقترنة. ns = غير مهم عن طريق اختبار t المقترن. (ب) إجمالي عدد الخلايا للعينات المعالجة باستخدام تدرج الكثافة (المربعات ، الشريط الداكن) مقابل الطرق القائمة على الخرز (الدوائر ، الشريط المفتوح) ل 8 عينات مقترنة. * تم تحديد P &lt; 0.05 باستخدام اختبار t المقترن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="قابلية الخلايا للبقاء والرسوم البيانية لعدد الخلايا الإجمالي. طريقة تريبان بلو المعالجة اليدوية مقابل المعالجة الآلية." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> الشكل 4: مقارنة بين الطرق اليدوية والآلية القائمة على الخرز. (أ) متوسط صلاحية الخلية (± SD) للعينات المعالجة باستخدام يدوي (مربعات ، شريط داكن) مقابل الطرق الآلية (الدوائر ، الشريط المفتوح) القائمة على الخرز ل 8 عينات مقترنة. ns = غير مهم بواسطة اختبار مان ويتني. (ب) إجمالي عدد الخلايا للعينات المعالجة باستخدام يدوي (مربعات) مقابل الطرق الآلية (الدوائر) القائمة على الخرز ل 8 عينات مقترنة. ns = غير مهم عن طريق اختبار t المقترن. (ج) وقت المعالجة ل 8 عينات تمت معالجتها باستخدام يدوي مقابل الطرق الآلية ، بما في ذلك التدريب العملي (شريط الضوء) والفترات الزمنية لعدم التدخل (الشريط المظلم). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="قابلية الخلية للبقاء والرسوم البيانية الغلة; المعالجة اليدوية مقابل المعالجة الآلية. وشملت جداول التحليل الإحصائي." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> الشكل 5: صلاحية وإنتاجية PBMC المعزولة عن الطريقة القائمة على الخرز إما يدويا أو باستخدام الأتمتة وفقا للوقت بين جمع العينات وتخزين PBMC. (أ) متوسط صلاحية الخلية (± 95٪ CI) لعينات المشاركين التي تمت معالجتها باستخدام دليل (شريط داكن) مقابل الطرق الآلية (الشريط المفتوح) القائمة على الخرز. جدول يوضح بالتفصيل أعداد المشاركين. ns = غير مهم. غير متوفر = غير قابل للتطبيق. * p &lt; 0.05 بواسطة اختبار المقارنة المتعددة ل Tukey. (ب) إجمالي عدد الخلايا لعينات المشاركين التي تمت معالجتها باستخدام دليل (شريط داكن) مقابل الطرق الآلية (الشريط المفتوح) القائمة على الخرز. جدول يوضح بالتفصيل أعداد المشاركين. ns = غير مهم. غير متوفر = غير قابل للتطبيق. * p &lt; 0.05 بواسطة اختبار المقارنة المتعددة ل Tukey. لا توجد قيمة لليوم 10 الآلي نظرا لأن رقم النسخ المتماثل أقل من 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 1: شكل استرداد النسبة المئوية للخلية التفاضلية باستخدام تدرج الكثافة والطرق القائمة على الخرز. تم حساب النسبة المئوية باستخدام عدد الخلايا المطلق قبل العزل في الدم الكامل وتعليق الخلايا بعد العزل باستخدام طريقة تدرج الكثافة (المربعات ، الشريط الداكن) والطريقة القائمة على الخرز (الدوائر ، الشريط المفتوح) (ن = 8). ns = غير مهم ، و * p &lt; 0.05 كما هو محدد بواسطة اختبار t غير المقترن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 1: بروتوكول تدرج الكثافة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%201_editedv2.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 2: تحضير 0.1 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0 في PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%202_editedv2.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 3: الإجراءات التفصيلية التي تم تنفيذها لتوليد البيانات التمثيلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%203_editedv2.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

يفصل هذا البروتوكول طريقة متوافقة مع الأتمتة عالية الإنتاجية لعزل خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية لأغراض البنوك الحيوية وأغراض أخرى.

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in ...

isolating-human-peripheral-blood-mononuclear-cells-from-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يشرح الفيديو طريقة لتنقية الخلايا البائية عن طريق الاستهداف المناعي المغناطيسي والفصل عن تعليق خلايا الدم المحيطية أحادية النواة. تتضمن الطريقة وضع العلامات على أنواع الخلايا غير المرغوب فيها بأجسام مضادة أو روابط محددة (مرتبطة بجسيمات مغناطيسية) تستهدف بروتينات سطح خلية معينة ، ليتم استنفادها من تعليق الخلية غير المتجانسة عن طريق الفصل المغناطيسي.

الانتقاء المناعي السلبي: طريقة لتنقية الخلايا البائية من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة

في هذا الفيديو ، نوضح عزل الخلايا الوحيدة عن دم الإنسان الكامل عن طريق الفصل السلبي المناعي المغناطيسي. يمكن استخدام الخلايا الوحيدة المعزولة لمزيد من التحليل النهائي.

عزل الخلايا الوحيدة عن الدم الكامل عن طريق الانتقاء السلبي المناعي المغناطيسي

في هذا الفيديو ، نوضح عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة ، PBMCs ، التي تحتوي على خلايا وحيدة وخلايا ليمفاوية من طبقة مصفرة بشرية عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. يمكن استخدام PBMCs المعزولة لمزيد من التحليل.

عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة عن المعاطف الروائية البشرية

في هذا الفيديو ، نوضح عزل الخلايا البائية عن الدم المحيطي البشري باستخدام الأجسام المضادة البيوتينيل الخاصة بالخلايا غير البائية والميكروبيدات المغناطيسية المترافقة بالستربتافيدين.

عزل وتنقية الخلايا البائية من الدم المحيطي البشري

يوضح هذا الفيديو تقنية لتوليد فئران جهاز المناعة البشري (HIS). يتم عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم CD34 + (HSCs) من خلايا معطف دم الحبل السري البشري باستخدام حبات مغناطيسية مغلفة بالأجسام المضادة. يتم توسيع CD34 + HSCs في وسط نمو غني بالسيتوكينات وحفظه بالتبريد. أخيرا ، يتم حقن الخلايا الجذعية السرطانية المذابة في جرو فأر يعاني من نقص المناعة لإنشاء نموذج الفأر HIS.

عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم في دم الحبل السري لتوليد فئران الجهاز المناعي البشري

الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) تمثل مصدرا للأنسجة المريض محددة للتطبيقات السريرية والبحوث الأساسية. هنا، نقدم بروتوكول مفصلة لإعادة برمجة الخلايا البشرية الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء المجمدة في iPSCs مجانا الفيروسية باستخدام غير دمج-البلازميدات episomal.

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من المجمدة بافي معاطف استخدام غير دمج-Episomal البلازميدات

هنا ، نوضح كيف يتم عزل الخلايا الوحيدة عن طريق فصل الخرزة المغناطيسية عن خلايا الدم المحيطية أحادية النواة بعد الطرد المركزي المتدرج للكثافة للدم البشري المضاد للتخثر. بعد الحضانة لمدة 5 أيام ، يتم تمييز الخلايا الوحيدة البشرية إلى خلايا متغصنة غير ناضجة وتكون جاهزة للإجراءات التجريبية في بيئة غير سريرية.

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

نقدم بروتوكولا بسيطا لعزل خلايا الدم الطرفية أحادية النواة من الدم الكامل الذي تم الحصول عليه من المرضى الذين تم تشخيصهم بمتلازمة سيزاري ، يليه اختيار الخلايا التائية CD4 + ، وتحفيزها باستخدام phorbol12-myristate13-acetate و A23187 ionophore ، وإعداد الحمض النووي الريبي للتنميط النسخي.

عزل خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النواة والخلايا التائية CD4+ من مرضى متلازمة سيزاري للتنميط النسخي

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لعزل العدلات من الدم كله، والمعاطف بافي، أو أغشية leukapheresis، وتحقيق عائد جيد، والنقاء العالي، والحد الأدنى من تنشيط الخلية. نحن نستخدم تنقية التدرج، وترسب خلايا الدم الحمراء (RBC)، وتحلل RBC للحصول على إعداد العدلات عالية الجودة / النقاء.

عزل العدلات البشرية من الدم الكامل والمعاطف بافي

وصفنا طريقة تجمع بين الخرز المغنطيسي المناعي وفرز الخلايا المنشط بالتألق لعزل وتحليل مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (الخلايا الوحيدة ، خلايا CD4 + T ، خلايا CD8 + T ، الخلايا البائية ، والخلايا القاتلة الطبيعية). باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تنقية الخلايا المغناطيسية والفلورية وتحليلها.

فصل المجموعات السكانية الفرعية للخلايا المناعية في عينات الدم المحيطية من الأطفال المصابين بكثرة الوحيدات المعدية

يقدم هذا البروتوكول دليلا يمكن الوصول إليه لجمع وتخزين وإذابة خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المناسبة لتحليلات المصب وسير العمل مثل قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي. كما يتم عرض مجموعات معطف البلازما وبافي.

عزل وحفظ خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية عالية القابلية للحياة من الدم الكامل: دليل للمبتدئين

تعلم عزل خلايا الدم البيضاء PBMCs من الدم المحيطي باستخدام الفصل المغناطيسي الآلي عالي الإنتاجية. تضمن هذه الطريقة حيوية الخلايا فوق 90% وتقلل جهد الفنيين مع زيادة تنوع العينات للبحوث المستقبلية.

عزل خلايا الدم البشرية الطرفية أحادية النواة من معاطف بافي عبر فصل حبة مغناطيسية مناعية عالية الإنتاجية

استكشف المزيد من الفيديوهات