الاستخلاص المعزز للحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي من مياه الصرف الصحي لإجراء تقييم شامل لمقاومة مضادات الميكروبات
يوليو 19, 2024
نقدم هنا تقنية بسيطة لتقييم المقاومة البيئية لمضادات الميكروبات (AMR) من خلال تعزيز نسبة الحمض النووي خارج الخلية منخفض الوزن الجزيئي. يسمح العلاج المسبق ب 20٪ -30٪ PEG و 1.2 M NaCl باكتشاف كل من جينات AMR المنقولة جينيا وأفقيا. يفسح البروتوكول نفسه لعملية خالية من الأدوات مع تحسين إضافي.
نحن مهتمون بالتطور والانتقال والآليات الجزيئية الكامنة وراء مقاومة المضادات الحيوية. على وجه التحديد ، يأتي العمل الذي يغذي هذه الورقة من اهتمامنا بالمقاومة البيئية. نحاول حاليا إنشاء قاعدة بيانات محلية لتتبع التباين الزماني المكاني في مقاومة مضادات الميكروبات باستخدام بيانات لمدة عام واحد.
يتم استخدام مزيج من التقنيات القائمة على الثقافة وعلم الجينوم للكشف عن مقاومة مضادات الميكروبات ورصدها. يخضع الحمض النووي المأخوذ من العينات لتسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو البندقية لتحديد التنوع الميكروبي واكتشاف جينات المقاومة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام metabarcoding ولوحات AMR القائمة على الجينات للكشف المتقدم عن مقاومة مضادات الميكروبات.
من المعروف أن الحمض النووي المجزأ منخفض الوزن الجزيئي هو مستودع لجينات مقاومة مضادات الميكروبات ، ولكن كان هناك القليل من التركيز على تطوير طرق خاصة بالاستخراج عالي الغلة للحمض النووي الخطي والمنخفض الوزن الجزيئي. ويركز عملنا على معالجة هذه الفجوة. يقدم بروتوكولنا خطوة بسيطة للمعالجة المسبقة لإثراء نسبة الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي المستخرج من مياه الصرف الصحي.
ونتيجة لذلك ، فإن هذا يلتقط مقاومة مضادات الميكروبات البيئية بالكامل دون استبعاد أجزاء الحمض النووي الحرة. يمكن تطوير هذا البروتوكول إلى طريقة خالية من الأدوات مع المزيد من العمل. وهذا بدوره يمهد الطريق لتطوير تقنيات فعالة من حيث التكلفة لالتقاط مقاومة مضادات الميكروبات البيئية.
نريد أن نتجاوز المقاومة الطفرية ونستكشف مساهمة الآليات غير الوراثية في مقاومة المضادات الحيوية. نحن مهتمون على وجه التحديد بمقارنة المساهمات النسبية لنقل الجينات الأفقي والطفرات الجينومية للتكيف مع المضادات الحيوية في بيئات مختلفة.
نظرة عامة
تطور هذه الدراسة تقنية جديدة لتقييم المقاومة للمضادات الميكروبية (AMR) في البيئة من خلال إثراء الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) خارج الخلوي ذو الوزن الجزيئي المنخفض من عينات مياه الصرف الصحي. ويتيح هذا البروتوكول الكشف عن جينات المقاومة للمضادات الميكروبية الجينية والمنقولة أفقيًا، مما يوفر طريقة منخفضة التكلفة ولا تتطلب أطقم اختبار جاهزة لتتبع المقاومة للمضادات الميكروبية في البيئة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- مقاومة مضادات الميكروبات (AMR)
- علم الأحياء الدقيقة البيئي
- الوراثة الجزيئية
خلفية علمية
- تطور وانتقال مقاومة المضادات الحيوية في البيئات الطبيعية
- أوجه القصور الحالية في تقنيات استخلاص الحمض النووي DNA ذو الوزن الجزيئي المنخفض ذات الإنتاجية العالية
- أهمية تتبع مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) من أجل الصحة العامة
الطرق المستخدمة
- استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتسلسل الشوتجن (shotgun sequencing) لتوصيف التنوع الميكروبي
- استخدام البولي إيثيلين جلايكول وكلوريد الصوديوم لاستخلاص الحمض النووي (DNA)
- الكشف المتقدم عن مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) عبر الترميز الميتاباركي واللوحات القائمة على الجينات
النتائج الرئيسية
- تحسين استخلاص الحمض النووي الخطي ومنخفض الوزن الجزيئي
- النجاح في التقاط كل من أجزاء الحمض النووي الجينومي والحمض النووي الحر المرتبط بمقاومة مضادات الميكروبات (AMR)
- عمل تأسيسي للتطورات المستقبلية في تقنيات الكشف عن مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) البيئية
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة طريقة فعالة لتقييم مقاومة مضادات الميكروبات البيئية (AMR)
- تعزز المزيد من الأبحاث حول العوامل الوراثية وغير الوراثية التي تساهم في مقاومة المضادات الحيوية
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يعد الكشف الشامل عن مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) في العينات البيئية أمراً بالغ الأهمية للتقييم المبكر للمخاطر ومراقبة الصحة العامة. يتيح الاستخلاص المعزز للحمض النووي (DNA) منخفض الوزن الجزيئي من مياه الصرف الصحي توصيفاً أكثر اكتمالاً لمخازن جينات AMR، بما في ذلك تلك التي تنتشر عبر نقل الجينات الأفقي. وتعزز هذه القدرة من الثقة التنبؤية في مراقبة AMR البيئية وتدعم القرارات المتعلقة بمجموعات استراتيجيات المراقبة والتخفيف.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استقصاء مستودعات جينات AMR البيئية بما يتجاوز الحمض النووي داخل الخلايا.
- يدعم التحقق الوظيفي من حركة جينات AMR ومسارات انتقالها.
- يعزز الثقة التنبؤية في نماذج المخاطر البيئية لظهور AMR.
الفحص وتطوير المقايسة
- يسهل تحضير عينات DNA المناسبة للألواح الميتاجينومية وألواح مقاومة مضادات الميكروبات القائمة على PCR.
- يعزز قابلية تكرار المقايسة من خلال توحيد استخلاص DNA المجزأ وخارج الخلية.
- يمكّن من الكشف الموثوق عن شظايا جينات مقاومة مضادات الميكروبات ذات الوفرة المنخفضة لإجراء التحليلات اللاحقة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يوائم مراقبة مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) البيئية مع اكتشاف المؤشرات الحيوية الانتقالية لصالح الصحة العامة.
- يدعم الاستمرارية بدءاً من الكشف البيئي وصولاً إلى التقييم قبل السريري لمخاطر انتشار مقاومة مضادات الميكروبات (AMR).
- يوفر تقليلاً للمخاطر من خلال التوصيف الآلي عبر رصد كل من العناصر المقاومة الجينية وتلك التي تنتقل أفقياً.
تكامل سير العمل والمسارات التحليلية
تدمج طريقة الاستخلاص هذه في مسار المراقبة البيئية، بدءاً من جمع العينات وصولاً إلى التحليل الميتاجينومي وتحديد خصائص جينات AMR.
- بيولوجيا الاكتشاف: تتيح اختبار الفرضيات المتعلقة بمدى انتشار جينات مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) وحركيتها في بيئات مياه الصرف الصحي.
- الفحص: توحد عملية استخلاص DNA لضمان اكتشاف كمي وقابل للتكرار لجينات AMR.
- التحليلات: توفر DNA عالي المردود ومنخفض الوزن الجزيئي لإجراء تحليلات مقارنة قوية عبر العينات والنقاط الزمنية المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بين الكشف عن مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) البيئية واستراتيجيات المؤشرات الحيوية للصحة العامة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تقدم بروتوكولاً قابلاً للتوسع ومستقلاً عن أطقم الاستخلاص التجارية، ويمكن تكييفه مع مختلف المصفوفات البيئية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في مراقبة مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) من خلال استخلاص الحمض النووي المجزأ وخارج الخلوي.
- القيمة التشغيلية: تقديم بروتوكول استخلاص قياسي وعالي المردود مناسب للمراقبة الروتينية.
- القيمة الاستراتيجية: تمكين اتخاذ قرارات مدروسة بشأن المضي قدماً أو التوقف فيما يتعلق باستثمارات الحد من مقاومة مضادات الميكروبات ومراقبتها.
- تأثير المحفظة: دعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لبرامج مراقبة مقاومة مضادات الميكروبات البيئية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في استخلاص الحمض النووي البيئي (environmental DNA) والتحليل الجزيئي اللاحق.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة الطرد المركزي، وقياس الطيف الضوئي، والبنية التحتية القياسية للبيولوجيا الجزيئية.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق لضمان إمكانية تكرار معالجة العينات ومقارنة البيانات.
- قابل للتكيف مع أنواع مختلفة من عينات مياه الصرف الصحي والعينات البيئية من خلال تحسين البروتوكول.
- يقتصر بضرورة التعامل الدقيق مع الحمض النووي المجزأ لتجنب فقده أثناء المعالجة.
