Name: الكشف القوي عن تضخيم الجينات في العينات المضمنة بالبارافين الثابتة بالفورمالين عن طريق التهجين الفلوري في الموقع (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:35:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: اكتشف تقنية التهجين الفلوري في الموقع لتحليل تضخيم الجينات في العينات المضمنة بالبارافين الثابتة بالفورمالين. تُحسّن هذه الطريقة جودة البيانات لفهم تقدم السرطان.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SW هو باحث ومدعوم من معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس (RR210034)

تمت الموافقة على بروتوكول البحث هذا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع للمركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس. تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المرضى قبل الجراحة.
1. الكواشف وإعداد المواد
<ol><li>قم بإعداد محلول كلوريد الصوديوم 0.2 نيوتن (HCl) في غطاء دخان عن طريق إضافة 8.212 مل من حمض الهيدروكلوريك ببطء (37٪ وزن / وزن أو 12.1 نيوتن) إلى 491.788 مل من ddH2O. يخزن في درجة حرارة الغرفة (RT). تنبيه: أضف الحمض ببطء إلى الماء. لا تضيف الماء إلى الحمض.</li>
	<li>تحضير محلول حامض الستريك 10 mM (pH 6.0) عن طريق إذابة 1.47 g من سترات ثلاثي الصوديوم (ثنائي الهيدرات) في 400 مل من ddH2O. استخدم حمض الهيدروكلوريك للتكيف مع الرقم الهيدروجيني 6.0 ، ثم ارفع الحجم النهائي إلى 500 مل مع ddH2O. قم بتخزين المخزن المؤقت في RT.</li>
	<li>قم بإعداد محلول Tween-20 بنسبة 10٪ بإضافة 100 ميكرولتر من Tween-20 إلى 900 ميكرولتر من ddH2O. قم بتخزينه في RT.</li>
	<li>قم بإعداد محلول IGEPAL بنسبة 10٪ بإضافة 5 مل من IGEPAL CA-630 إلى 45 مل من ddH2O. قم بتخزينه في RT.</li>
	<li>قم بإعداد محلول 20x SSC (درجة الحموضة 7.0 ، 3 M كلوريد الصوديوم ، 0.3 M سيترات الصوديوم) عن طريق إذابة 44.1 جم من سترات الصوديوم الثلاثية (ثنائي الهيدرات) و 87.65 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) في 900 مل من ddH2O. استخدم حمض الهيدروكلوريك للتكيف مع الرقم الهيدروجيني 7.0 ، ثم ارفع الحجم النهائي إلى 1000 مل باستخدام ddH2O. قم بتخزين المخزن المؤقت في RT.</li>
	<li>قم بإعداد محلول 2x SSC بإضافة 100 مل من 20x SSC إلى 900 مل من ddH2O. إذا لزم الأمر ، أضف 0.5 مل من المواد الحافظة (جدول المواد). قم بتخزينه في RT.</li>
	<li>قم بإعداد مخزن تهجين المسبار عن طريق خلط 910 ميكرولتر من ddH2O ، و 500 ميكرولتر من 20x SSC ، و 50 ميكرولتر من 10٪ Tween-20 ، و 40 ميكرولتر من RNase A ، و 1 مل من 50٪ كبريتات ديكستران ، و 2.5 مل من الفورماميد. القسمة إلى 1 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بإعداد 0.4x SSC بمحلول IGEPAL بنسبة 0.3٪ عن طريق خلط 100 مل من 2x SSC و 15 مل من 10٪ IGEPAL و 385 مل من ddH2O. قم بتخزينه في RT.</li>
	<li>قم بإعداد 2x SSC بمحلول IGEPAL بنسبة 0.1٪ بإضافة 5 مل من 10٪ IGEPAL إلى 495 مل من محلول 2x SSC. قم بتخزينه في RT.</li>
	<li>قم بإعداد محلول الهضم Proteinase K حديثا قبل الاستخدام عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من Proteinase K إلى 99 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA.</li>
	<li>قم بإعداد مخزون تخزين DAPI 1 مجم / مل عن طريق إذابة 1 مجم من DAPI في 1 مل من ddH2O. قم بتخزينه في -20 درجة مئوية وبعيدا عن الضوء. قم بإعداد حل عمل DAPI عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من مخزون تخزين DAPI إلى 999 ميكرولتر من محلول 2x SSC. يحفظ بعيدا عن الضوء حتى الاستخدام.</li>
</ol>2. عينة المعالجة المسبقة
ملاحظة: تحتوي الشريحة المستخدمة هنا على العينة.
<ol><li>عمر الشريحة عند 60-90 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أو طوال الليل (الشكل 1). ملاحظة: تسهل هذه الخطوة ذوبان البارافين. عادة ، 20 دقيقة من التدفئة كافية. يمكن تمديده إلى ليلة واحدة لاستيعاب الجدول الزمني.</li>
	<li>قم بإزالة الشريحة عن طريق غمرها في الزيلين أو بدائلها في وعاء كوبلين لمدة 10 دقائق. كرر هذه الخطوة مع الزيلين الطازج أو بدائله. قم بإجراء جميع خطوات المعالجة المسبقة والغسيل التالية في جرة كوبلن. ملاحظة: بدائل الزيلين هي بدائل آمنة وصديقة للبيئة للزيلين. أحد البدائل (انظر جدول المواد) يعمل بشكل جيد مثل الزيلين ، إن لم يكن أفضل. على الرغم من أن بدائل الزيلين تنتج رائحة أقل من الزيلين ، إلا أنه يوصى باستخدامه داخل غطاء الدخان. إذا لم يكن من الممكن الوصول إلى بدائل الزيلين ، فإن جميع الإجراءات متوافقة مع إزالة البارفين القائم على الزيلين دون أي تغييرات.</li>
	<li>اغسل بديل الزيلين بالإيثانول 100٪ لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>أعد ترطيب الشريحة بغمر الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>اغمر الشريحة في 0.2 نيوتن حمض الهيدروكلوريك (HCl) في RT لمدة 20 دقيقة. ملاحظة: يستخرج حمض الهيدروكلوريك بشكل فعال البروتينات القابلة للذوبان في الحمض ، مثل البروتينات النووية الأساسية ، لتحسين إمكانية الوصول إلى الحمض النووي لمجسات FISH11.</li>
	<li>اغمر الشريحة في 10 مللي متر من محلول حامض الستريك الساخن واحتضانها عند 90-95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ملاحظة: العلاج بحمض الستريك تحت درجات حرارة عالية يستخرج بالمثل البروتينات القابلة للذوبان في الحمض. يعتقد أن كلا العلاجين الحمضيين يستخرجان بروتينات مصفوفة خارج الخلية لتقليل التألق الذاتي12. يوصى بتسخين محلول الستريك مسبقا إلى نطاق درجة الحرارة المطلوب قبل تطبيقه على الشريحة. يمكن أن يكون الميكروويف طريقة ملائمة للقيام بذلك. الحمام المائي ، كما هو الحال مع طباخ سو فيد ، هو الحل الأكثر فعالية واقتصادية لحضانة درجات الحرارة العالية.</li>
	<li>اشطف الشريحة لفترة وجيزة في 2x SSC لتحييد درجة الحموضة.</li>
	<li>هضم الأنسجة عن طريق إضافة 100-200 ميكرولتر (ما يكفي لتغطية الأنسجة بالكامل اعتمادا على حجم القسم) من مخزن الهضم Proteinase K واحتضانه في RT لمدة 1 دقيقة. ملاحظة: يزيد هضم Proteinase K من إمكانية الوصول إلى مجسات FISH ويقلل من التألق الذاتي. يجب تحسين وقت الهضم بناء على أنواع الأنسجة. في معظم الحالات ، 1 دقيقة من الهضم كافية. يؤدي الإفراط في الهضم إلى مورفولوجيا نوى على شكل هالة ، ويجب تقليل وقت الهضم.</li>
	<li>أوقف على الفور هضم Proteinase K وقم بتجفيف الشريحة عن طريق غمرها في 70٪ إيثانول لمدة دقيقتين ، تليها معالجة الإيثانول بنسبة 85٪ و 100٪ لمدة دقيقتين لكل منهما.</li>
</ol>3. الأسماك والتصوير
<ol><li>قم بإعداد مزيج تهجين FISH عن طريق تخفيف 2 ميكرولتر من مخزون مسبار FISH مع 8 ميكرولتر من محلول التهجين ، ثم ضعه على الشريحة. قم بتغطية العينة بغطاء. ملاحظة: يتراوح إجمالي مخزون مسبار FISH المستخدم من 0.5-4 ميكرولتر ، اعتمادا على جودة الصورة. إذا كانت الإشارة منخفضة جدا ، فقم بزيادة إدخال المسبار. قلل من مدخلات مسبار FISH إذا كانت الخلفية عالية جدا ، خاصة عند ملاحظة حطام الفلورسنت خارج النوى. يمكن أن يكون المخزن المؤقت للتهجين هو الذي يتم توفيره مع المجسات المشتراة تجاريا أو يتم إعداده كما في القسم 1.</li>
	<li>ضع الشرائح على طبق ساخن ، مثل نظام تهجين الخندق المنزلق ، لتشويه الحمض النووي عند 75 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق. بعد ذلك ، انقل الشريحة إلى طبق ساخن آخر على درجة حرارة 37 درجة مئوية للتهجين طوال الليل. ملاحظة: إذا كانت اللوحة الساخنة تحتوي على صينية مياه أو خزان للحفاظ على الرطوبة أثناء التهجين ، فإن إغلاق غطاء الغطاء بالأسمنت المطاطي غير ضروري.</li>
	<li>بعد التهجين ، اغمس الشريحة في 40-60 درجة مئوية دافئة 0.4x SSC مع 0.3٪ IGEPAL CA-630 عازلة للغسيل ، ثم قم بإزالة غطاء الغطاء بعناية. استمر في الغسيل مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما في الظلام ، مع التحريك لأول 10-15 ثانية. ملاحظة: يساعد غمس الشريحة في المخزن المؤقت للغسيل على تحرير انزلاق الغطاء برفق.</li>
	<li>اغسل الشريحة في SSC بنسبة 0.1٪ IGEPAL CA-630 لمدة 5 دقائق في RT في الظلام ، مع الإثارة لأول 10-15 ثانية.</li>
	<li>لإخماد التألق الذاتي ، عالج الشريحة باستخدام مجموعة التبريد ذاتية التألق (انظر جدول المواد) عن طريق تطبيق 150 ميكرولتر من الكاشف (50 ميكرولتر + 50 ميكرولتر + 50 ميكرولتر من الكواشف A ، B ، C) لمدة 2-5 دقائق ، ثم اغسلها ب 2x SSC لمدة 5 دقائق. ملاحظة: هذه خطوة اختيارية. ينشأ التألق الذاتي للأنسجة بشكل أساسي من مكونات المصفوفة خارج الخلية ، مثل الكولاجين والإيلاستين. كما أنه يتأثر بشكل كبير بالليزوزومات والميتوكوندريا بسبب محتواها من الليبوفوسين و NADPH وأنزيم الفلافين. قد يؤدي تثبيت الألدهيد ووجود خلايا الدم أيضا إلى زيادة التألق الذاتيبشكل جيد 13,14.</li>
	<li>تلطيخ الشريحة مع DAPI لمدة 10 دقائق. اشطف الشريحة بمخزن مؤقت 2x SSC لمدة 5 دقائق. ملاحظة: إذا لم تتم معالجة الشريحة بواسطة مجموعة التبريد ذاتية التألق ، فيمكن تقليل تلطيخ DAPI إلى 2 دقيقة.</li>
	<li>اغمس الشريحة بسرعة في الماء منزوع الأيونات لمدة لا تزيد عن 1 ثانية ، ثم جففها بسرعة عن طريق امتصاص الرطوبة الزائدة بمنشفة ورقية. ملاحظة: هذه خطوة اختيارية. تمنع معالجة المياه منزوعة الأيونات بشكل فعال ترسب بلورات الملح للمخزن المؤقت SSC على الشريحة وتحسن جودة التصوير. ومع ذلك ، في ظل هذه الظروف الأيونات المنخفضة ، تضعف الروابط الهيدروجينية بين مسبار FISH والحمض النووي المستهدف ، مما يؤدي إلى تفكك المسبار وفقدان الإشارة. لذلك ، فإن الحفاظ على خطوة معالجة المياه لفترة قصيرة جدا أمر بالغ الأهمية.</li>
	<li>جفف الشريحة ، ثم قم بتركيبها باستخدام وسائط تثبيت مانعة للتلاشي. أغلق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر قبل التصوير. ملاحظة: إذا تمت معالجة الشريحة بواسطة كاشف التبريد ذاتي التألق ، فقم بتركيب الشريحة بوسيط تركيب مضاد للتلاشي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. علاوة على ذلك ، اعتمادا على نوع وسائط التركيب ، تصلب أو عدم تصلب ، يجب معالجة العينة لمدة 1-24 ساعة قبل الختم والتصوير. يوصى بمعالجة العينة بين عشية وضحاها على الأقل لتحقيق أفضل معامل انكسار للتصوير.</li>
	<li>استخدم عدسة زيتية 60× لالتقاط إشارة مضان. استخدم قناة DAPI لضبط التركيز. تأكد من الحصول على مكدسات Z متعددة. عادة ما تكون مداخن z 5-10 مع فاصل 1 ميكرومتر كافية. أداء أقصى إسقاط 3D لتحقيق أفضل قرار. قم بتطبيق فك الالتفاف أو خوارزميات مسح الخلفية الأخرى لتحسين جودة الصورة بشكل أكبر.</li>
</ol>

تعزيز تحليل FISH للدوافع المسرطنة في عينات الأنسجة السرطانية

<ol><li>ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+whole+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of whole genomes.</a> Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).</li>
<li>Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA%3A+An+emerging+hallmark+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer.</a> Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).</li>
<li>Luebeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+in+the+cancerous+transformation+of+Barrett%27s+oesophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett's oesophagus.</a> Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).</li>
<li>Nathanson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+resistance+mediated+by+dynamic+regulation+of+extrachromosomal+mutant+EGFR+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA.</a> Science. 343 (6166), 72-76 (2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+is+associated+with+oncogene+amplification+and+poor+outcome+across+multiple+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers.</a> Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).</li>
<li>Pal Choudhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+cross-resistance+in+small+cell+lung+cancer+due+to+extrachromosomal+DNA+amplification+of+MYC+paralogs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs.</a> Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).</li>
<li>Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+molecular+data+generated+with+FFPE+biospecimens%3A+Lessons+from+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature.</a> Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).</li>
<li>Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+diagnosis+and+tailored+therapies+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors.</a> Molecules. 25 (8), 1864(2020).</li>
<li>Cui, C., Shu, W., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Cell-based+genetic+diagnostic+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 89(2016).</li>
<li>Finn, E. H., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+DNA+FISH+protocol+to+visualize+genome+regions+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100741(2021).</li>
<li>Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections.</a> Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).</li>
<li>Richardson, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-fits-all+pretreatment+protocol+facilitating+fluorescence+in+situ+hybridization+on+formalin-fixed+paraffin-embedded%2C+fresh+frozen+and+cytological+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides.</a> Mol Cytogenet. 12, 27(2019).</li>
<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Annu+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+diminishing+autofluorescence+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+respiratory+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiang%2C+Z+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Lange, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+dynamics+of+extrachromosomal+DNA+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers.</a> Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ecDNA+hubs+drive+cooperative+intermolecular+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression.</a> Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).</li>
<li>Storlazzi, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors%3A+origin+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure.</a> Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li>
<li>Guerin, T. M., Marcand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakage+in+breakage-fusion-bridge+cycle%3A+an+80-year-old+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery.</a> Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).</li>
<li>Nguyen, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mapping+and+accelerated+super-resolution+imaging+of+the+human+genome+using+in+situ+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing.</a> Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).</li>
<li>Deshpande, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+landscape+of+focal+amplifications+in+cancer+using+AmpliconArchitect%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect.</a> Nat Commun. 10 (1), 392(2019).</li>
<li>Rajkumar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcSeg%3A+Semantic+segmentation+of+metaphase+images+containing+extrachromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA.</a> iScience. 21, 428-435 (2019).</li>
</ol>

سو عضو في المجلس الاستشاري العلمي لشركة Dimension Genomics Inc.

FISH هو خيار سريع وبأسعار معقولة للتشخيص الوراثي الخلوي. خاصة في تحديد ما إذا كان ecDNA موجودا في السرطان ، تظل أدلة FISH هي المعيار الذهبي1. يسمح FISH في أنسجة FFPE بالتحديد السريع لحالة الجينات في عينات خزعة المريض ، مما يسمح بتشخيص أسرع وتتبع التغييرات طوال تقدم المرض. هذه التقنية ذات قيمة خاصة لاختبار العينات السريرية التي تم جمعها بالفعل لعلم الأمراض.
يتضمن هذا البروتوكول عدة خطوات حاسمة. الخطوة الأولى هي إزالة البارافين الشاملة. يمكن أن يعطل البارافين المتبقي تهجين FISH. إذا كانت العينة لا تزال تبدو شمعية بعد الخطوة 2 ، فيجب معالجتها مرة أخرى بالزيلين الطازج أو بدائله.
ثانيا ، استخراج البروتين والهضم أمر بالغ الأهمية. لا تعزز هذه العمليات إمكانية وصول الحمض النووي إلى مسبار FISH فحسب ، بل تقلل أيضا بشكل كبير من التألق التلقائي. يتضمن هذا البروتوكول ثلاث خطوات لإزالة البروتين. في حين أن العلاج ب 0.2 N HCl و 10 mM من حامض الستريك واضح ومباشر ، فقد يتطلب هضم البروتين K التحسين. الإفراط في الهضم هو الخطأ الأكثر شيوعا عند استخدام البروتيناز K ، مما يؤدي إلى نوى على شكل هالة. سيؤدي تقصير وقت الهضم إلى تحسين مورفولوجيا النوى. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بعدم هضم أكثر من أربع عينات في وقت واحد لتقليل فارق التوقيت بين العينة الأولى والأخيرة. من المهم ملاحظة أنه حتى النواة السليمة قد تظهر كهالة تحت المجهر عالي التكبير وعالي الدقة. وذلك لأن النواة ليست على المستوى البؤري نفسه. لذلك ، يقترح أخذ مداخن Z متعددة وإجراء إسقاط أقصى لفحص التشكل النووي.
أخيرا ، يوصى بتبريد التألق الذاتي. على الرغم من أن استخراج الحمض وهضم البروتيناز K يمكن أن يقلل بشكل كبير من الخلفية المشتقة من البروتين ، إلا أن مستقلبات الفلورسنت قد لا تزال تؤثر على جودة التصوير.
بينما يوفر FISH دقة مكانية لا مثيل لها في تحديد تضخيم الجينات البؤري ، إلا أن له قيودا. أولا ، المحتوى والإنتاجية منخفضان مقارنة بنهج PCR أو تسلسل الجيل التالي (NGS). عادة ، يمكن تطبيق واحد إلى ثلاثة مجسات FISH بألوان مختلفة على شريحة واحدة بدون معدات متخصصة. ومع ذلك ، فإن التقدم في تقنيات الأتمتة جعل FISH عالي المحتوى وعالي الإنتاجية ، مثل التسلسل في الموقع 21 ، ممكنا. ثانيا ، يتطلب تصميم مسبار FISH معلومات مسبقة. وقد مكنت الجهود الجارية لتحديد أحداث التضخيم البؤري المتكررة في السرطان من إنشاء لوحات FISH مصممة مسبقا للتطبيقات المختبرية والسريرية. على سبيل المثال ، غالبا ما يتم تضخيم الجينات المسرطنة من عائلة MYC على أنها ecDNA في سرطان الرئة ذو الخلايا الصغيرة للتوسط في مقاومة العلاج الكيميائي. لذلك ، يمكن للوحة FISH التي تستهدف جينات MYC و MYCL و MYCN تسريع تحديد استجابات العلاج في الخزعات. وبالمقارنة ، يسمح NGS بفحص أكثر حيادية للجينات ذات الأهمية. ومع ذلك ، من بين التقنيات القائمة على NGS ، فقط تسلسل الجينوم الكامل مع تحليل مكلفللحساب 22 يمكن أن يميز ecDNA.
باختصار ، نقدم تعليمات قوية وشاملة للتحقيق في تضخيم الجينات البؤري في عينات FFPE. من خلال فحص نمط إشارة FISH ، يصبح من الواضح بشكل لا لبس فيه ما إذا كان يتم تضخيم موضع الجين وكيفية ذلك. نتوقع دمج التعلم الآلي في تحليل الصور23 من نوى الطور البيني لاستخراج المعلومات الوراثية الخلوية فيما يتعلق برقم النسخ وشكل التضخيم (كروموسوم أو ecDNA) ، وبالتالي تبسيط عملية التشخيص الجزيئي وتعزيز فهمنا للآليات المسببة للأمراض في السرطان.

تعد دراسة تضخيم الجينات السرطانية البؤرية أمرا بالغ الأهمية لأنها تدفع تكوين السرطان وتقدمه ومقاومة العلاج1. الأهم من ذلك ، قد تتضخم الجينات المسرطنة والجينات المناعية كحمض نووي خارج الكروموسومات (ecDNA) ، والتي يعزز وراثتها غير المتماثلة عدم التجانس الجيني في السرطان 2,3. تم ربط ecDNA بمقاومة العلاج والنتائج السريرية غير المواتية4،5،6.
تمثل عينات الأنسجة المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE) موردا أرشيفيا واسعا في مختبرات علم الأمراض ، مما يوفر معلومات وفيرة للدراسات بأثر رجعي. ومع ذلك ، فإن استخراج البيانات الجزيئية من عينات FFPE من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل أو التسلسل يمثل تحديا بسبب تجزئة الحمض النووي وتدهوره وربطه أثناء التثبيت7. من بين مجموعة التقنيات المتاحة للتحليل الجزيئي لأنسجة FFPE ، أثبت التهجين الفلوري في الموقع (FISH) فعاليته في تصور تسلسلات الحمض النوويالمحددة 8.
على الرغم من تقدم تقنيات التشخيص الجزيئي الحديثة ، فإن قدرة FISH على تصور وقياس تضخيم الجينات على مستوى الخلية الواحدة توفر رؤى قيمة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الورم والنتائج السريرية. باستخدام مجسات موسومة بالفلورسنت مكملة للجين المستهدف محل الاهتمام ، يمكن ل FISH حل توطين الجين الورمي بسهولة وقد يستنتج شكل تضخيم الجينات المسرطنة (مثل ecDNA) داخل الخلايا الفردية ، وهو أمر مستحيل أو مكلف من خلال تقنيات أخرى. لذلك ، يوفر FISH طريقة اقتصادية لتقييم عدم تجانس الورم والتطور النسيلي9. علاوة على ذلك ، سهلت التطورات في الأتمتة والتصوير والتحليل الحسابي التحليل عالي الإنتاجية لبيانات FISH ، مما مكن من القياس الكمي القوي لتضخيم الجينات عبر مجموعات الأنسجة الكبيرة10.
ومع ذلك ، فإن تطبيق FISH على أنسجة FFPE يمثل تحديات متأصلة ، بما في ذلك القطع الأثرية المتشابكة والتألق الذاتي في الخلفية. يتطلب التغلب على هذه العقبات تحسينا دقيقا لكل إجراء لضمان نتائج دقيقة وقابلة للتكرار. توفر هذه الورقة بروتوكولا محسنا خطوة بخطوة لتطبيق FISH للتحقيق في تضخيم الجينات في عينات أنسجة FFPE. باستخدام مسبار يستهدف موضع الجين ERBB2 (HER2) ، أثبتنا أن FISH يمكنه اكتشاف حالة تضخيم ERBB2 بقوة في عينات FFPE من مرضى سرطان الثدي. من الممكن حتى تقدير ما إذا كان ERBB2 يتم تضخيمه على أنه ecDNAs. من خلال تجميع الأدبيات الموجودة ونتائجنا التجريبية ، نوضح الاعتبارات المنهجية والتحديات التقنية والمزالق المحتملة للتحليل القائم على FISH. نناقش أيضا الأهمية السريرية لتوصيف التضخيم الجيني في أنواع مختلفة من السرطان ، مع تسليط الضوء على أهميتها النذير وإمكاناتها للاستراتيجيات العلاجية الشخصية.
باختصار ، تؤكد هذه الورقة على أهمية FISH كأداة قيمة لدراسة تضخيم الجينات في عينات أنسجة FFPE ، وتقديم رؤى لا مثيل لها في بيولوجيا الورم وتوجيه عملية صنع القرار السريري في علم الأورام. مع استمرار التحسين والتكامل مع المقايسات الجزيئية التكميلية ، يقف التحليل القائم على FISH على أهبة الاستعداد لزيادة تعزيز فهمنا لمسببات السرطان وتحسين نتائج المرضى في عصر الطب الدقيق.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5748</td><td>تلطيخ النواة</td></tr><tr><td>كبريتات ديكستران 50٪ محلول</td><td>EMD Millipore Sigma</td><td>S4030</td><td>مسبار التهجين المخزن</td></tr><tr><td>المؤقت ERBB2 (HER2) FISH Probe</td><td>Empire Genomics</td><td>ERBB2-20-RE</td><td>مسبار الأسماك</td></tr><tr><td>الإيثانول</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>تجفيف وترطيب الأنسجة</td></tr><tr><td>فورماميد</td><td>حراري علمي المواد الكيميائية</td><td>205821000</td><td>المخزن المؤقت للتهجين</td></tr><tr><td>الثابت 83 (بديل الزيلين)</td> <td>CBG Biotech</td><td>CH0104A</td><td>إزالة البارافين</td></tr><tr><td>حمض الهيدروكلوريك</td><td>فيشر كيميكال</td><td>A144-500</td><td>معالجة عينة</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 & nbsp ؛</td><td>الكيماويات الحرارية العلمية</td><td>J19628K2</td><td>غسيل الشرائح</td></tr><tr><td>Proclin 300</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48914-U</td><td>مادة حافظة للمخزن المؤقت SSC (اختياري)</td></tr> <tr><td>Proteinase K (800 وحدة / مل) New</td> <td>England Biolabs</td><td>P8107S</td><td>هضم البروتين</td></tr><tr><td>RNase A (20 مجم / مل) نيو</td> <td>إنجلاند Biolabs</td><td>T3018L</td><td>مسبار التهجين العازلة</td></tr><tr><td>نظام تهجين</td> <td>الخندق المنزلقBoekel Scientific</td><td>280001</td><td>عينة التهجين والتهجين. الألواح الساخنة البديلة مقبولة.</td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>فيشر الكيميائية</td><td>S2713</td><td>SSC عازلة</td></tr><tr><td>سترات الصوديوم ثنائي هيدرات</td><td>فيشر الكواشف الحيوية</td><td>FLBP3271</td><td>عازلة SSC والمعالجة المسبقة للعينة</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) عازلة</td><td>فيشر الحيوية</td><td>BP2473500</td><td>بروتيناز K عازلة الهضم</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher BioRecodes</td><td>BP337-500</td><td>مسبار التهجين عازلة</td></tr><tr><td>Vectashield مضاد للتلاشي تصاعد وسائل الإعلام</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>H190010</td><td>تصاعد الشريحة</td></tr><tr><td>Vector TrueVIEW</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>SP8400</td><td>طقم التبريد الذاتي الفلوري</td></tr></tbody></table>

الكشف القوي عن تضخيم الجينات في العينات المضمنة بالبارافين الثابتة بالفورمالين عن طريق التهجين الفلوري في الموقع

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

يلعب تضخيم الجينات البؤري، مثل الحمض النووي خارج الكروموسومات (ecDNA)، دورا مهما في تطور السرطان ومقاومة العلاج. في حين أن المنهجيات القائمة على التسلسل تمكن من تحديد غير متحيز للحمض النووي ecDNA ، فإن التقنيات القائمة على الوراثة الخلوية ، مثل التهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، تظل فعالة من حيث الوقت والتكلفة لتحديد ecDNA في العينات السريرية. يوفر تطبيق FISH في عينات الأنسجة المثبتة بالبارافين (FFPE) وسيلة فريدة للكشف عن الجينات المضخمة ، خاصة عندما لا تتوفر عينات قابلة للحياة لفحص النمط النووي. ومع ذلك ، هناك نقص في إجراءات توافق الآراء لهذه التقنية. يوفر هذا البروتوكول تعليمات شاملة ومحسنة بالكامل خطوة بخطوة لإجراء FISH للكشف عن تضخيم الجينات ، بما في ذلك ecDNA ، في عينات أنسجة FFPE التي تمثل تحديات فريدة يهدف هذا البروتوكول إلى التغلب عليها وتوحيدها. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين الحصول على بيانات تصوير عالية الجودة لتقييم تضخيم الجينات.

استخدمنا عينات FFPE من كل من سرطانات الثدي الإيجابية والسلبية HER2 لإثبات نتيجة تصوير FISH. يعد تضخيم HER2 (المشفر بواسطة جين ERBB2 ) علامة مواتية نظرا لتوافر وفعالية علاجات الاستهداف الجزيئي HER2. على العكس من ذلك ، فإن المرضى الذين يعانون من سرطانات الثدي الثلاثية السلبية ، والتي تفتقر إلى التعبير عن HER2 ، ومستقبلات هرمون الاستروجين (ER) ، ومستقبلات البروجسترون (PR) ، يواجهون نتائج سيئة بسبب الخيارات العلاجية المحدودة. لذلك ، فإن تحديد حالة HER2 أمر بالغ الأهمية في أبحاث سرطان الثدي وعلاجه15.
في عينة سرطان الثدي الثلاثية السلبية ، تعرض معظم النوى نقطتين متميزتين تمثلان إشارات HER2 / ERBB2 FISH. قد تحتوي بعض النوى على نقطة واحدة فقط بسبب تحيز التقسيم (الشكل 2 ، على اليسار). في المقابل ، تقدم العينات الإيجابية HER2 إشارات FISH وفيرة بنمطين مختلفين. يظهر أحد الأنماط نقاطا متناثرة في جميع أنحاء النواة (الشكل 2 ، الوسط). هذا النمط هو سمة من سمات مورفولوجيا ecDNA ، حيث قد لا تحتل ecDNAs منطقة نووية فريدة ومنظمة16. علاوة على ذلك ، يؤدي الفصل غير المتماثل ل ecDNAs أثناء الانقسام إلى اختلاف عدد النسخ ، مما يؤدي إلى عدم تجانس الإشارة بين النوى17. قد تظهر بعض النوى مجموعات عرضية ، مما يدل على محاور ecDNA18 (الشكل 2 ، يمين). يعرض النوع الآخر من تضخيم HER2 بشكل أساسي الركام المكثف على شكل قضيب. من المحتمل أن يشير هذا التشكل إلى التضخيم القائم على الكروموسومات ، مثل مناطق التلوين المتجانسة (HSR) 19 أو من خلال دورة جسر الانصهار والكسر (BFB)20. والجدير بالذكر أن تضخيم ecDNA و HSR و BFB يمكن أن يتعايش في نفس النواة. لذلك ، يوصى بفحص نوى متعددة لاستنتاج شكل التضخيم البؤري.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي ل FISH في عينات FFPE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig02.jpg"> الشكل 2: صورة FISH التمثيلية في عينات FFPE لسرطان الثدي. التكبير: 600x ؛ شريط المقياس: 10 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

يوفر هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لتصور تضخيم الجينات في عينات الأنسجة المضمنة بالبارافين (FFPE) المثبتة بالفورمالين.

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

robust-detection-gene-amplification-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Cancer Research

أبحاث السرطان

وتقدم تكنولوجيا الكشف ampliPHOX اللونية كبديل غير مكلف للكشف عن ميكروأرس مضان. استنادا بلمرة ضوئية المنشأ ، ampliPHOX تنتج البقع البوليمر الصلبة مرئية للعين المجردة في دقائق معدودة. ثم يتم تصوير النتائج وتفسيرها تلقائيا مع حزمة برامج بسيطة لكنها قوية.

ampliPHOX الكشف اللونية على ميكروأري الحمض النووي لمكافحة الأنفلونزا

يصف هذا الفيديو استراتيجية تهجين متسلسلة تتضمن تهجين مجسات mRNA إلى mRNA مستهدف محدد. بعد تهجين المسبار ، يتم إجراء تضخيم الإشارة لتحسين الدقة عن طريق تقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء أثناء RNA-CISH للعينات النسيجية.

تهجين المسبار وتضخيم الإشارة في تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع: تقنية للكشف عن تسلسلات الحمض النووي الريبي المحددة في أقسام الأنسجة

أنشأنا فلوري التهجين الموضع البروتوكول في للكشف عن فيروس الحمض النووي الجينوم المستمرة داخل أقسام الأنسجة من النماذج الحيوانية. هذا البروتوكول يتيح دراسة عملية العدوى عن طريق codetection من الجينوم الفيروسي، والمنتجات RNA لها، والبروتينات الفيروسية أو الخلوية داخل الخلايا واحد.

الكشف عن الجينوم والنصوص من الفيروسات الحمض النووي في الخلايا العصبية الأنسجة الثابتة التي كتبها نيون في الوضع الطبيعي التهجين جنبا إلى جنب مع المناعية

هنا ، نقدم طريقة بسيطة لإجراء التهجين الموضعي للحمض النووي الفلوري (DNA ISH) لتصور التسلسلات غير المتجانسة المتكررة على الكروموسومات المثبتة على الشريحة. تتطلب الطريقة الحد الأدنى من الكواشف وهي متعددة الاستخدامات للاستخدام مع المجسات القصيرة أو الطويلة ، والأنسجة المختلفة ، والكشف عن الإشارات الفلورية أو غير الفلورية.

طريقة بسيطة لDNA الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لسحق الكروموسومات

والهدف من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تنفيذ استخراج الحمض النووي الآلي من (FFPE) إشارة خطوط الخلايا الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين القياسية وقطرة الرقمية PCR (ddPCR) تحليل للكشف عن الطفرات النادرة في عملية إعداد سريرية. الكشف عن الطفرات في عينات FFPE يوضح فائدة سريرية من ddPCR في عينات FFPE.

توظيف الرقمية القطرة PCR لكشف الطفرات BRAF V600E في البارافين جزءا لا يتجزأ من خطوط الخلايا المعيار المرجعي الفورمالين الثابتة

الأسفار في الموقع التهجين (الأسماك) مطلوب غالباً في تركيبة مع الأنسجة والتشخيص الجزيئي لاختيار العلاج في الطب شخصية. مثبت أنسجة-الربط بين الصليب وخالية من الفورمالين رواية تسمح عالية الجودة، والسمات الجزيئية وتحليلات للأسماك من نفس العينة بإضافة خطوة بعد انتهاء التثبيت قبل تقديمها الأسماك.

بروتوكول ل HER2 الأسماك باستخدام مثبت أنسجة-الربط بين الصليب وخالية من الفورمالين للجمع بين مزايا الحفاظ على البرد والتثبيت الفورمالين

الجيش الملكي النيبالي هو موضح في الموقع البروتوكول التهجين يسمح الكشف عن الحمض النووي الريبي في أسرة المورفولوجية أجنة أو أنسجة تشريح. استخدام لوحات microtiter 96-جيدا وتضخيم إشارة تيراميدي، يمكن اكتشاف النصوص في عالية الدقة والحساسية، والإنتاجية، وتكلفة منخفضة نسبيا.

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

التمدد التكراري التهجين في الموقع (EASI-FISH) هو تقنية قوية تجمع بين الفحص المجهري التوسعي والتهجين الموضعي الفلوري (FISH) للكشف عن التعبير عن جينات متعددة في الأنسجة السميكة. يحدد هذا البروتوكول التطورات الحديثة في الطريقة وتكييفها لتسمية ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي السليم.

الكشف عن تعدد الإرسال للتعبير الجيني في دماغ ذبابة الفاكهة السليم باستخدام التألق التكراري بمساعدة التمدد في التهجين الموضعي

يصف البروتوكول مقايسة تهجين التألق المناعي الترادفي مع الأنسجة المضمنة بالبارافين المثبت بالفورمالين لاكتشاف وقياس الحمض النووي الريبي الصغير والبروتينات متعددة الإرسال في وقت واحد.

تضخيم الحمض النووي الريبي الصغير والتعرف عليه من خلال التهجين الموضعي الموضعي كطريقة جديدة للكشف والقياس الكمي

يوضح هذا البروتوكول كيفية توليد أورام نسيلي ملحوظ fluorescently، الذي يعرف وراثيا في ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي antennal (EAD) العين /. فهو يصف كيفية تشريح EAD والدماغ من يرقات العمر الثالث وكيفية معالجتها لتصور وتحديد التغييرات التعبير الجيني وغزو الورم.

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

اكتشف تقنية التهجين الفلوري في الموقع لتحليل تضخيم الجينات في العينات المضمنة بالبارافين الثابتة بالفورمالين. تُحسّن هذه الطريقة جودة البيانات لفهم تقدم السرطان.

الكشف القوي عن تضخيم الجينات في العينات المضمنة بالبارافين الثابتة بالفورمالين عن طريق التهجين الفلوري في الموقع

استكشف المزيد من الفيديوهات