Molecular Imaging of Human Brain Organoids Using Mass Spectrometry

Saleh  M. Khalil; Gerarda Cappuccio; Feng Li; Mirjana Maletic-Savatic

doi:10.3791/66997

التصوير الجزيئي لعضيات الدماغ البشري باستخدام قياس الطيف الكتلي

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Molecular Imaging of Human Brain Organoids Using Mass Spectrometry

التصوير الجزيئي لعضيات الدماغ البشري باستخدام قياس الطيف الكتلي

Full Text

1,417 Views

08:04 min

September 27, 2024

DOI: 10.3791/66997-v

Saleh M. Khalil*^1,2, Gerarda Cappuccio*^1,2, Feng Li^3,4, Mirjana Maletic-Savatic^1,2,4,5

¹Department of Pediatrics -Neurology,Baylor College of Medicine, ²Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children's Hospital, ³Department of Pathology & Immunology,Baylor College of Medicine, ⁴Center for Drug Discovery,Baylor College of Medicine, ⁵Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents an advanced method for mass spectrometry imaging (MSI) that allows for the detailed mapping of metabolite distributions within brain organoids. Utilizing in vitro models derived from induced pluripotent stem cells, the research investigates human brain metabolomics, especially during development and in relation to neurodevelopmental disorders.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Metabolomics
Mass Spectrometry Imaging

Background

Investigating metabolomics in vivo is challenging; thus, in vitro brain organoids are leveraged.
Recent advances in MSI offer new insights into the molecular mechanisms of brain development and disease.
Maintaining organoid morphology and integrity during imaging is critical for accurate data.

Purpose of Study

To develop a protocol for high-resolution MSI of brain organoids.
To explore metabolite signatures associated with specific cell types and neurodevelopment.
To identify potential therapeutic targets for neurodevelopmental disorders.

Methods Used

The study employs organoid models derived from induced pluripotent stem cells.
Brain organoids are prepared using specialized tissue handling and preservation techniques for MSI analysis.
The high-resolution MSI workflow includes detailed cryo-sectioning and optimization of mass spectrometry conditions.
Specific embedding protocols and settings for the mass spectrometer are outlined for reliable imaging results.

Main Results

Molecular mapping of the Krebs cycle metabolites was achieved in brain organoids.
High-resolution imaging revealed localized distributions of metabolites associated with neurogenesis.
The findings provide insights into the role of metabolites in brain development and potential therapeutic avenues.

Conclusions

The study demonstrates a robust approach for detailed metabolomic profiling in brain organoids.
The findings enhance understanding of neurodevelopment and could inform treatment strategies for developmental disorders.
This method holds promise for future research into metabolic processes underlying brain function.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using brain organoids in this study?

Brain organoids provide a relevant model for studying human brain development and disease due to their ability to mimic key aspects of brain tissue.

How is the biological model implemented in this research?

The study utilizes organoids derived from induced pluripotent stem cells, allowing for the investigation of human-specific neurodevelopmental processes.

What types of data are obtained from mass spectrometry imaging?

MSI provides spatially resolved metabolite distributions, enabling insights into metabolic pathways and their alterations during brain development.

How can this method be applied or adapted for future research?

The outlined MSI protocol can be adapted to investigate other organoid models or conditions, enhancing the study of metabolism in various diseases.

What are the key limitations or considerations for this study?

Maintaining the integrity and morphology of organoids during preparation and imaging is critical and can pose technical challenges.

تم تطوير طريقة متقدمة لتصوير قياس الطيف الكتلي (MSI) لعضيات الدماغ التي تسمح برسم خرائط لتوزيعات المستقلب داخل هذه النماذج. تقدم هذه التقنية رؤى حول مسارات التمثيل الغذائي للدماغ وتوقيعات الأيض أثناء التطور المبكر وفي المرض ، مما يعد بفهم أعمق لوظيفة الدماغ البشري.

درسنا التمثيل الغذائي للدماغ البشري النامي. تحد للتحقيق في الجسم الحي. لمعالجة هذا الأمر ، نستخدم نماذج عضيات الدماغ في المختبر ، وتقنيات التمثيل الغذائي الخاصة المتقدمة.

تم تطبيق التقنيات المتقدمة القائمة على التكنولوجيا الرئيسية بسرعة في السنوات الأخيرة لتوصيف العضوية ، وهو اتجاه من المتوقع أن يستمر. توضح الدراسات الأيضية الحديثة باستخدام التصوير الطيفي الكتلي أو MSI مزايا النماذج العضوية في فهم الآليات الجزيئية للتطور البشري والمرض ، بما في ذلك الحالات النادرة ، والتطبيقات في الطب الشخصي. يعد الحفاظ على السلامة الجزيئية ومورفولوجيا العضيات أثناء التصوير الجزيئي أمرا صعبا ، ويتطلب معالجة دقيقة للعينات وإعدادها. لمعالجة هذا الأمر ، تم تطوير تقنية متخصصة لتحليل MALDI MSI المتعدد عالي الدقة لعضيات الدماغ. إنه يحسن الطيف الكتلي بين ظروف التصوير والتسجيلات والحفاظ على الأنسجة لضمان بيانات موثوقة عالية الجودة. يوضح هذا البروتوكول الشامل إمكانات MSI عالية الدقة ، ويمنح الباحثين الموارد التي يحتاجونها للاستفادة الكاملة من هذه التكنولوجيا للتحقيق في التضاريس الأيضية للعضيات بالتفصيل.

سيعلن بحثنا عن فهمنا لتكوين الخلايا العصبية ، المستقلب المرتبط بأنواع معينة من الخلايا في عضيات الدماغ. لن يضيء هذا التنميط الأيضي التفصيلي قاعدة هذه المستقلبات في نمو الدماغ فحسب ، بل سيحدد أيضا الهدف المحتمل للتدخلات العلاجية التي تقلد اضطرابات النمو العصبي.

[الراوي] للبدء ، قم بإزالة القارورة التي تحتوي على عضيات الدماغ المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من الحاضنة. باستخدام أطراف التجويف العريض ، انقل العضيات من القارورة إلى الطبق. اغسل العضيات ثلاث مرات باستخدام DPBS بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم لشطف الوسائط. ثم اشطفها بسرعة بالماء المقطر لإزالة أي أملاح من DPBS. أضف 10 ملليغرام من الجيلاتين الذي تم الحصول عليه من جلد السمك البارد في قارورة تحتوي على 100 مل من DPBS. سخني المزيج وحركيه على حرارة 70 إلى 80 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم انقل المحلول إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة الفقاعات. باستخدام طرف ماصة صغير ، قم بتثبيت العضوية في وسط قالب بلاستيكي. صب محلول تضمين الجيلاتين بنسبة 10٪ برفق في القالب حتى يتم غمر العضوي بالكامل. ضع القالب في طبق بتري يحتوي على الإيثانول البارد بنسبة 100٪ على الثلج الجاف. عندما يتم تجميدها تماما ، كما يتضح من تغيير اللون إلى الأبيض الصلب ، قم بإزالة كتلة الجيلاتين العضوي من طبق بتري. لف الكتلة بورق الألمنيوم أو ضعها في كوب من الصفيح. أغلق الكتلة وخزنها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لقسم التبريد. لتقسيم التبريد، ضع الكتل البلاستيكية التي تحتوي على عضويات داخل حجرة التبريد المثبتة على درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم في التبريد ، قم بتقسيم العضيات إلى أقسام 14 ميكرومتر ، وقم بتثبيتها على شرائح زجاجية مطلية بأكسيد القصدير الإنديوم لتصوير قياس الطيف الكتلي أو MSI. قم بتخزين الشرائح على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى التصوير. للبدء ، قم بإزالة الشريحة المطلية بأكسيد القصدير الإنديوم المثبتة بأقسام عضوية في الدماغ من 80 درجة مئوية تحت الصفر. ضع الشريحة في مكان مجفف لمدة 20 دقيقة لتقليل تكثيف المياه الجوية على السطح. بعد التجفيف ، باستخدام بخاخ هوائي ساخن ، رش 10 ملليغرام لكل مليلتر NEDC في 70٪ من الميثانول على الأقسام العضوية. لتحقيق منصة MALDI MSI عالية الدقة لتصور المستقلبات العضوية للدماغ ، قم بتركيب مصدر أيون مع واجهة قمع أيونية مزدوجة على مطياف الكتلة. استخدم ليزر ND ثلاثي التردد Q المتصل بطول موجي 349 نانومتر ، ومعدل تكرار يبلغ كيلو هرتز واحد ، وطاقة نبضة تبلغ حوالي 1.3 إلى 1.4 ميكرو جول. لتجنب الإفراط في أخذ العينات ، ركز الليزر على حجم بقعة يبلغ قطره حوالي 15 ميكرومتر. قم بإرفاق العينة بمرحلة حاقن MALDI. قم بتشغيل وصيانة قمع أيون الضغط العالي عند 7.4 إلى 7.5 Torr ، وقمع أيون الضغط المنخفض عند 1.6 إلى 1.8 Torr. قم بتطبيق جهد تردد الراديو من 780 كيلو هرتز عند ذروة 191 فولت إلى الذروة إلى المستوى المنخفض ، و 604 كيلو هرتز عند 80 فولت من الذروة إلى ذروة المسارات الأيونية ذات الضغط العالي. لتحسين حساسية المستقلبات الصغيرة في نطاق الكتلة المنخفضة، قلل اتساع الترددات الراديوية في قمع الضغط المنخفض والعالي لمصدر MALDIDMSI إلى حوالي 20 و 15٪ على التوالي. اضبط دقة الكتلة على 70,000. ثم حدد المساحة وحجم البكسل البالغ 25 ميكرومتر لكل بكسل. اضبط نطاق الشحن الرئيسي بين 80 إلى 900 في كل من الوضعين الأيوني السالب والموجب. احتفظ بالتحكم التلقائي في الكسب في إيقاف التشغيل ، ثم اضبط وقت الحقن على 250 مللي ثانية ، واحصل على أطياف كتلة تحويل furier في وضع الملف الشخصي. قم باستيراد البيانات الطيفية لقياس الطيف الكتلي مباشرة إلى البرنامج المتوافق. قم بإجراء تصحيح خط الأساس باستخدام خوارزمية الالتواء ، وتطبيع البيانات باستخدام إجمالي عدد الأيونات. قم بإنشاء قائمة ميزات الصور الأيونية من ملفات البيانات الأولية باستخدام عرض حاوية لشحنة دلتا الرئيسية يساوي 0.01 أو 5:00 صفحة في الدقيقة لتمييز صور نسبة الشحن الرئيسية بناء على عيب الكتلة وتغطية البكسل. قم بإنشاء صور ملونة زائفة أو RGB من أنواع أيون المستقلب الفردية. قم بتحميل قائمة نسبة الشحن الرئيسية لملفات البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من MALDI MSI إلى قاعدة بيانات التمثيل الغذائي البشري لتحديد المستقلبات. تم تعيين مستقلبات كريبس ذات الصلة بدورة كريبس في 60 يوما من عضيات الدماغ البشري مكانيا باستخدام MSI مع تضمين جيلاتين السمك.