الضوء المرتبط ثنائي اللون والفحص المجهري الإلكتروني لتصور التفاعلات بين الميتوكوندريا والليزوزومات
سبتمبر 27, 2024
يصف هذا البروتوكول آلية لاستخدام الضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني لتصور تفاعل الميتوكوندريا والليزوسومات المسماة ب mEosEM و APEX2 ، على التوالي.
يرتبط الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا بالعديد من الأمراض ، وخاصة الاضطرابات التنكسية العصبية والتمثيل الغذائي. لذلك ، إذا تمكنا من فهم كيفية تنظيم الميتوكوندريا بواسطة الجسيمات الحالة ، فهذا يساعد على تطوير استراتيجيات علاجية جديدة. في هذا البروتوكول ، أظهرنا طريقة CLEM ثنائية اللون لتصور ملامسة الجسيم الليزومي للميتوكوندريا.
الضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني هو تقنية تصوير تجمع بين مزايا الفحص المجهري الضوئي والفحص المجهري الإلكتروني. في هذا البروتوكول ، نعمل على زيادة ميزة CLEM باستخدام مجسات ثنائية اللون لتصور ملامسة الليزوسوم في الميتوكوندريا. من الصعب التمييز بوضوح بين الميتوكوندريا المتدهورة داخل الجسيمات الحالة باستخدام طرق أخذ العينات المجهرية الإلكترونية التقليدية.
تقدم هذه الدراسة نتيجة CLEM عالية الدقة أظهرت بوضوح المجال المستجيب للليزوسومات والميتوكوندريا. تم استخدام طريقة أخذ اللون المزدوج للتمييز بدقة بين مؤثرات الميتوكوندريا داخل الجسيمات الحالة كشف بحثنا أن الميتوكوندريا تتفاعل مع الجسيمات الحالة.
كشف بحثنا أن الميتوكوندريا تفاعلت مع الجسيمات الحالة بطرق مختلفة استجابة للضغوط الخارجية المختلفة. من خلال دراسة أسباب ومنظمي هذه الظواهر ، سنكتسب نظرة ثاقبة لفهم مراقبة جودة الميتوكوندريا داخل الخلايا. للبدء ، قم بزراعة خلايا HeLa بكثافة واحدة في 10 أس خمسة في أطباق ثقافة شبكية زجاجية مقاس 35 ملم.
في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا بشكل مشترك عند التقاء 30٪ إلى 40٪ مع البلازميدات باستخدام كاشف التعداد. بعد التعدي ، عالج الخلايا بثنائي ميثيل سلفوكسيد أو U18666A والبافيلوميسين A1 لمدة 18 ساعة. للتصوير متحد البؤر ، قم بإزالة وسائط الثقافة وأضف على الفور 250 ميكرولتر من محلول التثبيت الدافئ عند 30 إلى 37 درجة مئوية.
قم بإزالة المثبت على الفور. استبدلها ب 1.5 مل من المثبت الطازج واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 10 دقائق كل منها بمليلتر واحد من محلول كاكوديلات الصوديوم المثلج 0.1 مولار.
بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الجلايسين البارد سعة 20 ملليمولار لإخماد الألدهيد. بعد احتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق ، اغسلها ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في محلول كاكوديلات الصوديوم البارد 0.1 مولار. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول Amplex الأحمر إلى طبق العينة واحتضنه لمدة خمس دقائق على الثلج.
بعد ذلك ، قم بإزالة محلول Amplex الأحمر واشطف الخلايا ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها بمحلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار. استخدم مجهريا متحد البؤر لتصوير المنطقة المحيطة بالخلايا ذات الأهمية في وضع مسح البلاط ثلاثة × ثلاثة. التقط كلا من تباين التداخل التفاضلي وإشارات الفلورسنت لتحديد وتسجيل الشبكة والحروف على طبق الشبكة باستخدام هدف 40 مرة.
قم بتصوير الخلايا المستهدفة بتكبير عال باستخدام هدف 40 مرة واحصل على صورة Z-stack. بعد تصوير خلايا Amplex الملطخة باللون الأحمر باستخدام مجهر متحد البؤر ، أضف ملليلترا واحدا من رابع أكسيد الأوزميوم المخفض بنسبة 1٪ عند أربع درجات مئوية واحتضنه لمدة ساعة واحدة. ثم اشطف العينة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق كل منها بالماء المقطر عند أربع درجات مئوية.
يجفف في سلسلة الإيثانول المتدرجة لمدة 15 دقيقة في كل مرة في درجة حرارة الغرفة. الآن امزج الإيثانول مع راتنجات الايبوكسي بنسب حجم من ثلاثة إلى واحد ، واحد إلى واحد ، وواحد إلى ثلاثة ، مع إعداد ما مجموعه 300 ميكرولتر من كل خليط. يسكب كل خليط راتنجات الايبوكسي في الطبق ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك ، قم بإعداد كبسولة التضمين عن طريق ملئها براتنجات الايبوكسي الطازجة. اقلب الأنبوب أو الكبسولة رأسا على عقب في المنطقة التي تهمك وضعه في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة حتى يتبلمر. ثم اغمر الزجاج السفلي وكتلة البوليمر في النيتروجين السائل لفصلهما.
ضع كتلة العينة في حامل العينة من الميكروتوم الفائق وضعه في كتلة التشذيب. استخدم شفرة حلاقة لتقليم الراتنج إلى شكل مستطيل أو شبه منحرف حول الكائن محل الاهتمام. ضع كتلة العينة المشذبة في حامل العينة واضبط الشفرة الماسية.
باستخدام ميكروتوم فائق ، قم بقطع أقسام رفيعة للغاية على بعد حوالي 60 إلى 70 نانومتر من الخلايا المدمجة المسطحة. اجمع الأقسام التسلسلية على شبكة فتحة مطلية بالفورفار قبل تجفيفها على طبق ساخن. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأقسام بصبغة التباين لمدة دقيقتين وقم بتغطية سترات الرصاص لمدة دقيقة واحدة.
ثم ضع الشبكة في المجهر الإلكتروني للإرسال ، أو TEM ، حامل العينة للمراقبة. استنادا إلى صورة تباين التداخل التفاضلي من المجهر الضوئي ، حدد الخلية المستهدفة ذات الأهمية وصور منطقة الخلية بأكملها باستخدام صور متداخلة متجانبة عند تكبير 1 ، 700 مرة للحصول على صور المجهرية الضوئية والإلكترونية المترابطة لخلايا HeLa باستخدام ImageJ Fiji ، ابدأ ImageJ Fiji وانقر على ملف ، جديد ، TrakEM2 فارغ ، وحدد مجلد التخزين لإنشاء مشروع TrakEM2 جديد. اسحب بيانات صورة التجانب الأولية وأفلتها في مساحة العمل لفتح مجموعة بيانات صورة التجانب.
انقر فوق زر الماوس الأيمن وحدد الخط ومونتاج جميع الصور في هذه الطبقة ومراسلات الكتل غير الخطية المرنة. ثم انقر فوق موافق لقبول القيم الافتراضية للمعلمات المتبقية. بعد ذلك ، انقر فوق زر الماوس الأيمن وحدد تصدير ، متبوعا بإنشاء صورة مسطحة لإنشاء صورة مخيطة.
ثم انقر فوق ملف واحفظه باسم لحفظ الصورة. لتغيير حجم الصورة الفلورية، افتح برنامج تكبير الصور. انقر فوق ملف ، وافتح الصورة وحددها.
أدخل العرض والارتفاع. لمطابقة حجم صورة المجهر الإلكتروني. حدد الخوارزمية المراد تطبيقها في طريقة تغيير الحجم.
انقر فوق ملف واحفظه لحفظ الصورة التي تم تغيير حجمها. افتح ImageJ Fiji واسحب وأفلت التألق الذي تم تغيير حجمه والصورة المجهرية الإلكترونية المخيطة في مساحة العمل. انقر فوق المكونات الإضافية عارض البيانات الضخمة والاعوجاج الكبير لبدء التسجيل.
ثم انقر فوق القائمة المنسدلة لتحديد صورة الميكروغراف الفلوري كصورة متحركة وصورة المجهر الإلكتروني كصورة مستهدفة. باستخدام وظائف مثل التكبير / التصغير وتدوير الصورة والتحرك ، قارن بين الصور المجهرية المضان والإلكترون. اضغط على مفتاح المسافة على لوحة المفاتيح للتبديل إلى وضع المعالم واضغط على زر الماوس الأيسر لتمييز ثلاثة معالم على الأقل تم تحديدها في كلتا الصورتين.
بعد وضع علامة على جميع المعالم المحددة ، انتقل إلى ملف ، وتصدير الصورة المتحركة ، وانقر فوق موافق. ستظهر نافذة منبثقة جديدة مع صورة الرسم المجهري الفلوري المحولة. انقر فوق الملف واحفظه لحفظ صورة الميكروغراف الفلورية المحولة.
لتراكب صور CLEM ، اسحب وأفلت صورة الميكروغراف المجهري الفلوري المحولة وصورة المجهر الإلكتروني المخيط في مساحة عمل ImageJ. انقر فوق الصورة والنوع واللون ثمانية بت. لتعيين نفس نوع الصورة لكل من الصور المجهرية الفلورية والإلكترونية.
انقر فوق الصورة واللون ودمج القنوات. لدمج الصور. انقر فوق ملف واحفظه لحفظ صورة CLEM.
لوحظت الميتوكوندريا المحاصرة داخل الجسيمات الحالة في الخلايا المعالجة بالبافيلومايسين A1 مما يشير إلى تثبيط الالتهام الذاتي وانخفاض جودة الميتوكوندريا ، بينما أظهرت خلايا التحكم الميتوكوندريا تتفاعل مع الجسيمات الحالة ولكن لم تغمرها ، أظهر اضطراب الميتوكوندريا الذي لوحظ في خلايا التحكم أن الميتوكوندريا تحيط بالليزوسومات بدلا من أن تغمرها. أظهرت الخلايا المعالجة U18666A تفاعلات متزايدة بين الميتوكوندريا والليزوزومات ، مع ابتلاع بعض الجسيمات الحالة بواسطة الميتوكوندريا.
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة لاستخدام الميكروسكوب الضوئي والإلكتروني المترابط (CLEM) لتصور التفاعلات بين الميتوكوندريا والليزوزومات باستخدام مسبارين لوني. من خلال فهم كيفية تنظيم الميتوكوندريا بواسطة الليزوزومات، يمكن الحصول على رؤى حول تطوير استراتيجيات علاجية للأمراض المرتبطة بالخلل الوظيفي للميتوكوندريا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- تقنيات الميكروسكوب
الخلفية
- يرتبط الخلل الوظيفي للميتوكوندريا بالعديد من الأمراض، وخاصة الاضطرابات التنكسية العصبية.
- يمكن أن يؤدي فهم تنظيم الميتوكوندريا بواسطة الليزوزومات إلى تطوير استراتيجيات علاجية.
- يمكن أن تخفي الطرق التقليدية لتصوير هذه التفاعلات تفاصيل مهمة.
- يوفر الميكروسكوب الضوئي والإلكتروني المترابط طريقة لجمع تقنيات التصوير.
هدف الدراسة
- لتصور تفاعلات الميتوكوندريا والليزوزومات باستخدام التصوير عالي الدقة.
- لتمييز التفاعلات تحت ضغوط خارجية مختلفة.
- لتعزيز فهم مراقبة جودة الميتوكوندريا داخل الخلايا.
الطرق المستخدمة
- تم إجراء زراعة خلايا HeLa في أطباق زجاجية بقاعدة شبكية قطرها 35 مم.
- تم تعديل الخلايا بالبلاسميدات لاحقًا بالعوامل الدوائية.
- تم استخدام الميكروسكوب المجسم والإلكتروني الانتقالي لتصوير الخلايا.
- تم إجراء CLEM باستخدام مسبارين لوني لتسهيل تصور الميتوكوندريا داخل الليزوزومات.
- تم إجراء خطوات احتضان وغسل محددة لتحضير العينات للتصوير.
النتائج الرئيسية
- تكشف الدراسة عن تفاعلات واضحة بين الميتوكوندريا والليزوزومات تحت ظروف مختلفة.
- أبرز التصوير عالي الدقة الهياكل الخلوية واستجاباتها للضغوط الخارجية.
- تم الحصول على رؤى ميكانيكية حول تنظيم الميتوكوندريا بواسطة الليزوزومات.
- أشارت نتائج التحقق إلى طرق تصوير موثوقة لدراسة تفاعلات العضيات.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة فعالية CLEM ثنائي اللون في التحقيق في تفاعلات العضيات.
- توفر التحسينات في تقنيات التصوير طرقًا جديدة للبحث في مراقبة جودة الميتوكوندريا.
- قد يكون للاستنتاجات المستخلصة من هذا البحث آثار على فهم وعلاج الأمراض المرتبطة بالخلل الوظيفي للميتوكوندريا.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Dual-color correlative light and electron microscopy (CLEM) enables high-resolution visualization of mitochondria-lysosome interactions, addressing a critical gap in understanding organelle dynamics relevant to disease mechanisms. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in early discovery, particularly for programs focused on mitochondrial quality control and cellular stress responses. Integrating CLEM into discovery pipelines enhances predictive confidence for portfolio decisions involving organelle-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of organelle contact sites, supporting functional target validation.
- Clarifies mechanistic pathways of mitochondrial regulation by lysosomes under stress conditions.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing distinct interaction phenotypes in response to pharmacological perturbation.
- Supports predictive confidence for advancing mitochondrial quality control targets.
Screening & Assay Development
- Provides validated imaging outputs for downstream assay development and compound screening.
- Enables reproducible quantification of organelle interactions using dual-color labeling.
- Supports standardization of imaging-based readouts for screening platforms targeting organelle dynamics.
- Improves reliability of phenotypic screening for compounds modulating mitochondria-lysosome crosstalk.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular stress models for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies in fixed cells.
- Provides risk-adjusted data for advancing organelle-targeted interventions in preclinical models.
- Enhances predictive de-risking for mitochondrial dysfunction programs.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-color CLEM method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation, enabling robust hypothesis testing and pathway clarification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of organelle interactions and quality control mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution, dual-modality data for comparative analysis of cellular responses to stressors.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by modeling disease-relevant organelle dynamics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse organelle-targeted research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in organelle-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across research teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial and lysosomal targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced microscopy and dual-color probe labeling.
- Demands access to confocal and electron microscopy infrastructure with image registration capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- Adaptation to other cell types or disease models may require probe optimization.
- Potential artifacts from fixation and sectioning must be carefully controlled and interpreted.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:49
Cell Transfection and Confocal Imaging for Observing the Interactions Between Mitochondria and Lysosomes in Fixed Cells
4:05
Sample Preparation for Electron Microscopy Block, Sectioning and Transmission Electron Microscopy (TEM) Imaging
6:34
Image Processing and Generation of the CLEM Image using ImageJ Fiji
8:00
Landmark-Based Image Registration with the Big Warp Plugin
9:43
Representative Results
