Name: مقايسة ترابط القرب لتوطين البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: اكتشف تقنية مقايسة ترابط القرب لتوطين تفاعلات البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي باستخدام خط خلايا U2OS. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة استجابة الخلية للضرر الجيني بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>تقييم تفاعل البروتين وتوطينه في تلف الحمض النووي

<ol><li>Xiao, W., Samson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+endogenous+DNA+alkylation+damage+as+a+source+of+spontaneous+mutation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).</li>
<li>Lindahl, T., Barnes, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+endogenous+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of endogenous DNA damage.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).</li>
<li>DNA damage, aging, and cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22N+Engl+J+Med%22">N Engl J Med</a>. Hoeijmakers Jan, H. J. 361 (15), 1475-1485 (2009).</li>
<li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+Making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: Making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EnvironMol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX%3A+a+sensitive+molecular+marker+of+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair.</a> Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+phosphorylated+H2AX+foci+formation+and+DNA+repair+assembly+at+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+heterodimerization+of+protein+isoforms+using+an+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (140), (2018).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Nguyen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nek4+regulates+entry+into+replicative+senescence+and+the+response+to+DNA+damage+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts.</a> Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).</li>
<li>Basei, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Animal+Cell+Culture+Guide%22">Animal Cell Culture Guide</a>. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).</li>
<li>Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II%CE%B1-dependent+induction+of+a+persistent+DNA+damage+response+in+response+to+transient+etoposide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22MolOncol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure.</a> MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etoposide-induced+DNA+damage+affects+multiple+cellular+pathways+in+addition+to+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response.</a> Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEK5+interacts+with+topoisomerase+II%CE%B2+and+is+involved+in+the+DNA+damage+response+induced+by+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide.</a> J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).</li>
<li>George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+proximity+ligation+assay+%28PLA%29+for+detection+of+RNA-protein+complex+interactions+in+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).</li>
<li>Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+assay+for+specific+RNA-protein+interactions+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells.</a> RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).</li>
<li>Hegazy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assay+for+detecting+protein-protein+interactions+and+protein+modifications+in+cells+and+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ.</a> Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ألواح سوداء 384 بئر لوحات</td><td>حاملة خلية بيركين إلمر حمار</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; مضاد للأرانب أليكسا فلور 488</td><td>إنفيتروجين</td><td>A21206</td><td>1:300</td></tr><tr><td>ثنائي وصلة حمار مضاد للفأر ناقص</td><td>سيجما</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink مخفف الأجسام المضادة</td><td>سيجما</td><td>DUO82008</td><td></td></tr><tr><td>حل حجب Duolink 1X</td><td>سيجما</td><td>DUO82007</td><td></td></tr><tr><td>كاشف الكشف عن Duolink Far Red</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Donkey المضاد للماعز بالإضافة إلى</td><td>Sigma</td><td>DUO92003</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Donkey المضاد للأرانب بالإضافة إلى</td><td>Sigma</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>تم استخدام الماعز المضاد ل Nek4</td><td>سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية</td><td>SC-5517</td><td>الماعز المضاد ل Nek4 عند التخفيف 1:50</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo</td><td>H1399</td><td>0.6 & جم / مل</td></tr><tr><td>Leica DMI مجهر</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti Ku70</td><td>Thermo</td><td>MA5-13110</td><td>تم استخدام الماوس المضاد ل Ku70 في 1: 100 تخفيف</td></tr><tr><td>الماوس المضاد TOPII & beta ؛</td><td>سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية</td><td>SC-365071</td><td>1:25</td></tr><tr><td>الأرنب المضاد ل Nek5</td><td>سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية</td><td>SC-84527</td><td>1:25</td></tr><tr><td>الأرنب المضاد ل Y H2AX</td><td>خلية الإشارات</td><td>9718S</td><td>1:100 التخفيف</td></tr><tr><td>U2OS خط الخلية</td><td>ATCC</td><td>HTB-96 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

مقايسة ترابط القرب لتوطين البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

لقد لاحظنا تفاعل Nek4-Ku70 في غياب علاج الإيتوبوزيد. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث هذا التفاعل خارج النواة (الشكل 1 أ). يزداد تفاعل Nek4-Ku70 بعد تلف الحمض النووي ويتركز في النواة (الشكل 1 أ). في حالة تفاعل Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ) ، المستخدم في هذا الاختبار كعنصر تحكم إيجابي بناء على نتائج الأدبيات18 ، يزداد التفاعل بشكل كبير عن طريق علاج الإيتوبوسيد (الشكل 1 ب).
يعزز علاج الإيتوبوسيد زيادة بنسبة 40٪ تقريبا (بمتوسط 9 نقاط / نواة في الخلايا المعالجة بالمركبات مقابل 12-14 نقطة / نواة في الخلايا المعالجة بالإيتوبوسيد). لا يستبعد تفاعل Nek4 و Ku70 ظروف تلف الحمض النووي. في الواقع ، أظهر Nguyen et al.12 أن هذه البروتينات يمكن أن تتفاعل في حالة عدم وجود إهانة خلوية ولا تعتمد على الحمض النووي ، مما يعني أن التفاعل ليس دائما في مواقع تلف الحمض النووي.
تلطيخ γ-H2AX غائب في ظروف التحكم ولكنه يزداد بعد 20 دقيقة من علاج الإيتوبوسيد ويستمر حتى 3 ساعات من العلاج (الشكل 1 ج). بعض نقاط التفاعل قريبة من تلطيخ γ-H2AX (الشكل 1C). بعد ساعة واحدة من العلاج ، تتركز معظم نقاط تفاعل Nek4-Ku70 في بؤر تلف الحمض النووي (الشكل 1 ج).
تبلغ الضربة القاضية ل Nek4 حوالي 70٪ (لم يتم تقديم البيانات) ، مما يعني أنه لن يتم التخلص من الإشارة تماما. نعتقد أن الاختلاف في عدد النقاط / النوى لا يعادل استنفاد البروتين لأن البروتين الذي يذكرنا سيخصص للاستجابة لتلف الحمض النووي ثم يتفاعل مع Ku70. متوسط النقاط / النواة الموجودة في خلايا ضربة قاضية Nek4 المعالجة لمدة 3 ساعات باستخدام الإيتوبوسيد هو 10 ، مما يعني انخفاضا بنسبة 30٪ مقارنة بخلايا التحكم PLKO في نفس الحالة. إذا اعتبرنا أن الإيتوبوسيد يزيد من تفاعل Nek4-Ku في 40٪ المتعلقة بالخلايا المعالجة بالمركبات ، ولدينا 70٪ من ضربة قاضية Nek4 ، فستقدم الخلايا المقلدة حوالي 10 نقاط / نواة. لا يستبعد تفاعل Nek4 و Ku70 استجابة تلف الحمض النووي ، وعلى الرغم من زيادته بعد تلف الحمض النووي ، إلا أن التغيير الرئيسي يكمن في توطين التفاعل.
تقدم النتائج الموضحة هنا أداة مهمة لتوطين تفاعل البروتينات في سياق استجابة تلف الحمض النووي. تم تورط Nek4 و Ku70 بالفعل في نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج ، ويبدو أن Nek4 مهم لتجنيد Ku70 / Ku80 في بؤر تلفالحمض النووي 12. ومع ذلك ، يمكن استكشاف الخصائص المكانية والزمانية لهذا التفاعل باستخدام PLA بالتزامن مع تلطيخ γ-H2AX.
يمكن أن توفر التقنيات الأخرى ، مثل الترسيب المناعي المشترك والتألق المناعي ، معلومات مماثلة ، ولكن بشكل منفصل. يسمح استخدام علامة γ-H2AX كمرجع بالمراقبة الزمنية والمكانية للتفاعل.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67072/67072fig01v4.jpg"> الشكل 1: تفاعل Nek4 - Ku70 في ظروف تلف الحمض النووي. (أ) تم تحضين خلايا U2OS بالإيتوبوسيد (25 ميكرومتر) لمدة 20 دقيقة و 1 ساعة و 3 ساعات. بعد العلاج ، تم تثبيت الخلايا بالميثانول المثلج ، وتم إجراء جيش التحرير الشعبى الصينى باستخدام الماعز المضاد ل Nek4 والفأر المضاد ل Ku70 كأجسام مضادة أولية. تم تلطيخ النواة ب Hoechst 33342 ويتم تقديمها باللون الأزرق. يتم عرض نقاط جيش التحرير الشعبى الصينى باللون الأحمر. كانت الخلايا الضابطة عبارة عن خلايا عولجت بالإيتوبوسيد لمدة ساعة واحدة وتحضنها فقط بجسم مضاد أولي واحد (الماعز المضاد ل Nek4) وكلا الأجسام المضادة الثانوية. كانت المكافحة البيولوجية هي خلايا ضربة قاضية Nek4 (shRNA Nek4) عولجت لمدة 3 ساعات باستخدام إيتوبوسيد. (ب) التحكم الإيجابي في الفحص بناء على نتائج الأدبيات: تم تحضين خلايا U2OS ب 25 ميكرومتر من الإيتوبوسيد لمدة ساعة واحدة ، وتم إجراء PLA مع الفأر المضاد ل Nek5 والأرانب المضاد ل TOPIIβ. يمثل الرسم البياني تجربة واحدة ويمثل متوسط الخطأ القياسي (SEM) من جميع الخلايا المكونة من 4 حقول مختلفة على الأقل (35 خلية على الأقل للتحكم و 50 خلية لجميع الحالات الأخرى). تم الحصول على الأهمية باستخدام اختبار t و *: p&lt;0.05 و ** p&lt;0،01 و *** p&lt;0،001 مقارنة بمركبة DMSO. (ج) بعد جيش التحرير الشعبى الصينى ، تم غسل الخلايا المعروضة في (أ) باستخدام PBS واحتضانها بجسم مضاد للأرانب مضاد γ-H2AX. بعد 1 ساعة من الحضانة ، تم استخدام الجسم المضاد الثانوي ضد الأرانب للكشف عن بؤر تلف الحمض النووي ويتم تقديمه باللون الأخضر. يتم تكبير المناطق التي تحتوي على تلطيخ مشترك ل PLA و γ-H2AX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/67072fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 1: هيكل المجلد. يجب وضع الصور من Nucleus و PLA في مجلدات مختلفة ، كما هو موضح هنا. يجب أن تبدأ أسماء الملفات ببادئة محددة (على سبيل المثال ، DAPI ، PLA) ويجب أن تحتوي على صورة مقابلة في كل مجلد (على سبيل المثال ، DAPI_control1.tif و PLA_control1.tif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الشكل التكميلي 2: نافذة معلمات الكلرو. بعد فتح / تشغيل الماكرو في ImageJ / FIJI ، سيطلب من المستخدم اختيار مجلدات البيانات وإدخال المعلمات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
ملف الترميز التكميلي 1: ملف ماكرو تم إنشاؤه ل ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/pla_dots_per_nucleus_basei_et_al_2024.zip" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

proximity-ligand-assay-to-localize-proteins-in-dna-damage-sites

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يصف هذا الفيديو مقايسة ربط القرب لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في الموقع في خلايا الديدان الخيطية. يؤدي القرب الشديد من البروتينات ذات الأهمية إلى إنشاء قالب الحمض النووي الدائري بمساعدة مسبار PLA المتصل بجسم مضاد ثانوي. يتم تضخيم المسبار بشكل أكبر باستخدام محلول التضخيم ، والذي ينتج حمض نووي طويل أحادي الشريطة متبوعا بتهجين مسبار الكاشف ، مما يتيح توطين تفاعلات البروتين والبروتين في الخلايا.

مقايسة ربط القرب لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في الموقع

وكثيرا ما تستخدم أشعة الليزر في دراسات الاستجابة الخلوية للتلف الحمض النووي. ومع ذلك، فإنها تولد الآفات التي تباعد، والتردد، والتصادم مع تكرار الشوك نادرا ما تتسم. هنا، نحن تصف النهج الذي تمكن من تحديد هذه المعايير مع الليزر المترجمة crosslinks interstrand.

واحدة تحليل جزيء من الليزر المترجمة السورالين Adducts

هنا، ويتبين كيف يمكن في الموقع التقريب التقارب القرب (جيش التحرير الشعبى الصينى) يمكن استخدامها للكشف وتصور التفاعلات البروتين البروتين مباشرة بين أتم و p53 في الثقافات خلية تعليق تتعرض للإجهاد السامة الجينات.

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

ميكرويرادييشن الليزر أداة مفيدة لإجراء دراسات لإصلاح الحمض النووي في الخلايا الحية. يتم عرض نهج منهجي لاستخدام أشعة الليزر فوق البنفسجية للحث على مختلف الآفات الحمض النووي. ونحن قد الأمثل طريقة ميكرويرادييشن المحلية أن يحافظ على دورة الخلية الطبيعية؛ وهكذا، خلايا المشع المضي قدما من خلال الانقسام.

تقنيات الفحص المجهري [كنفوكل] لدراسة تفاعلات البروتين البروتين وحركية في الحمض النووي آفات متقدمة

دراسة حركية إصلاح تلف الحمض النووي يتطلب نظاما للحث على الآفات في المناطق شبه نووية محددة. يصف لنا طريقة لإنشاء فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل المترجمة استخدام مجهر [كنفوكل] المسح الضوئي الليزر مزودة بليزر 405 نانومتر وتوفير إجراءات التشغيل الآلي التحديد الكمي للقوى المحركة لعوامل الإصلاح في هذه الآفات.

التحقيق في تجنيد البروتين للحمض النووي آفات استخدام الليزر 405 نانومتر الصغرى-التشعيع

والهدف من هذا البروتوكول بالتحديد الكمي لإصلاح كروسلينكس الحمض النووي-البروتين محددة على بلازميد الحمض النووي. هي transfected lesioned البلازميدات في خطوط خلايا الثدييات المتلقية والوزن الجزيئي المنخفض تحصد في وقت متعددة النقاط تعداء بعد. حركية إصلاح الحمض النووي كمياً استخدام ملحق التمهيدي حبلا محددة يتبعها qPCR.

مقايسة بسيطة وسريعة، والكمية لقياس إصلاح الحمض النووي-البروتين كروسلينكس على البلازميدات Transfected في خلايا الثدييات

بعد تلف الحمض النووي، تقوم الخلايا البشرية بتنشيط مسارات الإصلاح الأساسية لاستعادة سلامة جينومها. هنا، نحن وصف طريقة من المناعة غير المباشرةflufluorescence كوسيلة للكشف عن البروتينات إصلاح الحمض النووي، وتحليل توظيفها المكانية والزمانية، والمساعدة في استجواب التفاعل البروتين البروتيني في مواقع الضرر الحمض النووي.

التصور من الحمض النووي إصلاح البروتينات التفاعل من قبل immunofluorescence

في حين أن تصادم شوكة النسخ المتماثل مع الحمض النووي يمكن أن يؤدي إلى فواصل مزدوجة ، لا يعرف الكثير عن التفاعل بين الردود والآفات المانعة. لقد استخدمنا مقايسة ربط القرب لتصور هذه اللقاءات وتوصيف العواقب المترتبة على التكوين الردوي.

تصور اللقاءات المجيبة مع آفة حجب مستضد موسومة

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي ، باستخدام أمثلة على إنزيمات ligase و nuclease و polymerase. يستخدم الفحص قليل النيوكليوتيدات الموسومة بالفلورسنت وغير المسماة والتي يمكن دمجها لتشكيل دوبلكس تحاكي أضرار الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي أو وسيطة المسار ، مما يسمح بتوصيف سلوك الإنزيم.

استخدام قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية المعدلة لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي

وصفنا بروتوكول بسيطة لتحديد البروتينات التي تربط الدماغ إلى نهاية طول C الكامل لمستقبلات P2X2 ATP بوابات. ومن المتوقع التمديد والتطبيق المنهجي لهذه الطريقة لجميع المستقبلات P2X أن تؤدي إلى فهم أفضل للإشارات مستقبلات P2X.

البروتيوميات من التعرف على البروتينات التفاعل مع P2X2 قنوات الكاتيون يجند بوابات

اكتشف تقنية مقايسة ترابط القرب لتوطين تفاعلات البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي باستخدام خط خلايا U2OS. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة استجابة الخلية للضرر الجيني بدقة عالية.

مقايسة ترابط القرب لتوطين البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي

استكشف المزيد من الفيديوهات