تحليل خاص بالخيوط للبروتينات عند تكرار سلاسل الحمض النووي من خلال إثراء وتسلسل طريقة الحمض النووي الناشئ المرتبط بالبروتين

تركز أبحاثنا على آلية الوراثة اللاجينية على وجه التحديد ، اقترن تكرار الحمض النووي بعملية إعادة تدوير الهيستون الأبوي ، والتي تمثل الخطوة الأولى في الوراثة اللاجينية تم تحديد ترسيب هيستون الوالدين المتعدد الذي يشارك في تكرار الحمض النووي للعب دور مهم في إعادة تدوير الهيستون الأبوي.

وهذا يشمل مركب الهليكاز D ، بوليميراز الحمض النووي والنسخ المتماثل لمركب الحماية. كانت الأساليب الجينية والكيميائية الحيوية التقليدية قيما مستخدمة في هذا المجال البحثي. تقليديا ، يتم استخدام طرق تسلسل عالية الإنتاجية لفهم عملية نقل الهيستون الأبوي.

قبل إثراء وتسلسل الحمض النووي المرتبط بالبروتين ، أو طريقة التجربة ، كان من الصعب دراسة عملية نقل الهيستون الأبوية. كانت طريقة التجربة توفر أداة قوية لمعالجة هذه الأسئلة الأساسية. للبدء ، قم بحفظ كريات خلايا الخميرة وأعد تعليقها عن طريق دوامة لطيفة.

ثم اغسلها ب 0.4 مل من محلول تحلل CHIP الذي يحتوي على مثبطات البروتياز ومزيج من المضادات الحيوية لمنع التلوث البكتيري. الطرد المركزي الخليط على حرارة 5 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أضف 0.1 مل من محلول تحلل CHIP مع مثبطات الإنزيم البروتيني ومزيج المضادات الحيوية إلى الحبيبات.

متبوعا بحوالي 100 ميكرولتر من الخرز الزجاجي 0.5 ملم. قم بعمل تحلية الخلايا عن طريق زخرفة الخرز لمدة ثلاث دورات في غرفة باردة بأربع درجات مئوية. باستخدام إبرة ساخنة قياس 16 ، قم بعمل ثقوب في قاع الأنبوب.

اجمع المحللة عن طريق تعشيش الأنبوب المثقوب في أنبوب فارغ من الحمض النووي منخفض الربط سعة 1.5 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 1 ، 600 جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. شفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات. سيحتوي جزء حطام الخلية على الكروماتين.

أعد تعليق كريات الخلية عن طريق سحب 0.35 مل من نوكلياز المكورات الدقيقة المكملة ، أو المخزن المؤقت للهضم MNase. بعد ذلك ، أضف 10 وحدات من MNase إلى التعليق. تخلط برفق عن طريق التقليب أربع إلى ست مرات ، وتحتضن في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

قم بإخماد هضم MNase عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من 0.5 مولار EDTA إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ملليمول. تخلط برفق عن طريق الانعكاس ، وتوضع الأنبوب على الثلج لمدة 30 دقيقة على الأقل. باستخدام 1.5 ملليلتر Bioruptor microtubes ، صوتنة خليط التفاعل بقوة عالية لمدة ثلاث دقائق مع 30 ثانية على و 30 ثانية من الدورات.

ثم جهاز الطرد المركزي عند 10,000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 10،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم اجمع ما يقرب من 400 ميكرولتر من المادة الطافية.

وفر 30 ميكرولترا كمدخلات للحمض النووي لاستخراج الحمض النووي وتجميده عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. استخدم 370 ميكرولترا المتبقية من محللة الخلايا لترسيب هيستون كروماتين المناعي. للبدء ، قم بغلي حوالي 150 ميكرولترا من المدخلات التي تم الحصول عليها مسبقا وعينات H3K4me3 CHIP على كتلة حرارية 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، قم بتبريد العينة على الفور على الجليد لمدة خمس دقائق.

ثم أضف الكمية المطلوبة من المكونات المذكورة إلى العينة. قم بتغيير العينة لمدة ساعتين على دوار عند أربع درجات مئوية و 10 دورات في الدقيقة. انقل الخليط إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 20 ميكرولتر من حبات البروتين G Sepharose المغسولة.

قم بتغيير الخليط لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية على الدوار عند 10 دورة في الدقيقة. قم بتدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة عند 800 جم لمدة دقيقة واحدة. اغسل الخرزات ثلاث مرات بملليلتر واحد من برومو ديوكسي يوريدين البارد ، أو المخزن المؤقت للترسيب المناعي BrdU الذي يدور لمدة ثلاث دقائق لكل غسلة.

قم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى واغسله بمليلتر واحد من المخزن المؤقت TE لمدة ثلاث دقائق. قم بتدوير الأنابيب مرة أخرى عند 800 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وشفط المادة الطافية بعناية. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE مع 1٪ SDS إلى الخرز.

احتضن الخليط على حرارة 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم يدور على حرارة 800 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بتنقية المادة الطافية إلى 18 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف باستخدام أعمدة تنقية الحمض النووي للحصول على عينات الترسيب المناعي BrdU و H3K4me3 eSPAN. قم بإعداد مكتبة الحمض النووي أحادية الشريطة مع العينات المذكورة باتباع دليل إعداد SSDNA ومكتبة الحمض النووي منخفضة المدخلات.

قم بتنقية منتج الربط إلى 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت منخفض EDTA Elution. قم بتضخيم مكتبة الحمض النووي باستخدام 50 ميكرولترا من مزيج التفاعل من مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي المفردة التي تقطعت بها السبل. بعد الدورة المعروضة ، قم بتضخيم مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

قم بتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق مزجها مع 60 ميكرولتر من الخرز ، مسخنة مسبقا إلى 30 درجة مئوية. اخلطي منتجات PCR والخرز جيدا. دع الخليط يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

اربط الخرزات على حامل مغناطيسي لمدة ثلاث دقائق واغسلها مرتين ب 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪. جفف الخرزات في الهواء لمدة دقيقتين ، وقم بتخفيف الحمض النووي إلى 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت منخفض EDTA المتوفرة في مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي. قياس تركيز المكتبة وتوزيع حجم الأجزاء باستخدام أنظمة الرحلان الكهربائي عالية الدقة.

تجمع كميات متساوية من المكتبات الفردية ، بما في ذلك مدخلات H3K4me3 الترسيب المناعي للكروماتين ، والترسيب المناعي BrdU ، وعينات eSPAN لإجراء تسلسل نهائي مزدوج متوازي. كشف تحليل هلام نموذجي لمكتبة تسلسل الحمض النووي ل H3K4me3 eSPAN عن نمط سلم نيوكليوسوم الكروماتين. ظهر نطاق أحادي النوكليوسوم الرئيسي في 270 زوجا أساسيا حيث تمت إضافة المحولات إلى جزء الحمض النووي الذي تم الحصول عليه من الهضم.

كشفت خرائط العينة المختلفة عن قمم في النيوكليوسومات الفردية المحيطة بالأصل ، مما يكرر بشكل مستقل التسلسل 607 في الخلايا البرية و mcm2-3A. كشف متوسط تحيز الخيوط أنه في خلايا الخميرة البرية ، أظهر ترسب هيستون الوالدين تحيزا طفيفا نحو الخيط المتأخر. ومع ذلك ، في هيستون الوالدين المتحولة H3H4 تم نقله إلى الخيط الرائد.