خط أنابيب شامل لتقييم كفاءة تكون الكريات الحمراء البشرية في المختبر وخارج الجسم الحي

يركز بحثنا على سرطان الدم ، وتحديدا متلازمات خلل التنسج النقوي أو الأورام النخاعي. إنه مرض الخلايا الجذعية الذي ينشأ من الخلايا الجذعية المكونة للدم. يؤثر على سلالات خلايا الدم المختلفة ، وخاصة سلالة الكريات الحمراء المسؤولة عن إنتاج خلايا الدم في القلب.

يمكن أن يؤدي اضطراب هذه السلالة إلى فقر الدم ، والذي يظهر بشكل شائع في مرضى متلازمات خلل التنسج النقوي. يسمح خط الأنابيب الذي نقدمه في هذه المقالة بطريقة قوية ومبسطة لتقييم كفاءة الأرومة الحمراء البشرية في المختبر عند تعديل الجينات أو العلاج الدوائي. الخلايا الجذعية المكونة للدم موجودة منذ الولادة حتى اللحظة الأخيرة من حياتنا.

لم يعد هناك نسيج تكاثري في جسمنا مع إنتاج تريليونات الخلايا كل يوم. لا يزال هناك الكثير من الأشياء التي يجب فهمها ، لذلك سنواصل دراسة هذه الخلايا المدهشة في الأنسجة الأمينية السليمة مع التركيز القوي على البروتينات وبيولوجيا الحمض النووي الريبي. للبدء ، قم بإذابة 100،000 خلية CD34 + UCB عن طريق غمس القارورة لمدة 30 ثانية في حمام مائي مضبوطة على 37 درجة مئوية.

أضف ملليلترا واحدا من وسط إزالة الجليد بالتنقيط إلى القارورة ، ثم أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. انقل معلق الخلية المعلقة قطرة قطرة إلى خمسة ملليلتر من وسط إزالة الجليد. ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة ثماني دقائق عند 320 جم في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الخلايا في 10 ملليلتر من فرز الخلايا المنشطة بالفلورة أو المخزن المؤقت FACS باستخدام DNAse. بعد الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من وسائط التحفيز. انقل ملليلترين من تعليق الخلية إلى صفيحة 24 بئرا واحتضان اللوحة لمدة أربع إلى ست ساعات عند 37 درجة مئوية.

ثم اجمع الخلايا في أنابيب فرز الخلايا التي يتم تنشيطها بالفلورة وقم بتغطيتها بملليلتر واحد من وسط الخلايا الجذعية. بعد إذابة الفيروس ، أضف الحجم المطلوب إلى وسائط التحفيز لتحقيق تعدد العدوى 30. قم بتعليق الخلايا المحببة في وسائط تحتوي على فيروسات بكثافة 100،000 خلية لكل 100 ميكرولتر من الفيروس ونقلها إلى بئر واحد من صفيحة 96 بئرا.

أضف PBS إلى الآبار الفارغة واحتضنه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. ثم انقل الحجم الكامل لتعليق الخلية من بئر الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى أنابيب FACS مع مليلتر واحد من وسط الخلايا الجذعية. اغسل البئر وطرف الماصة بوسط الخلايا الجذعية لإضافة ملليلترين من وسط الخلايا الجذعية إلى أنبوب FACS.

بعد الطرد المركزي لأنبوب FACS ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلترين من وسائط التمدد. انقل المعلق إلى بئر من صفيحة 24 بئر واحتضان الخلايا. للبدء ، قم بنقل الحجم الكامل لخلايا CD34 + التي تم نقلها باستخدام مراسل EGFP إلى أنبوب FACS منفصل.

جهاز طرد مركزي عند 320 جم لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا المحببة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. أضف خمسة ميكرولترات من الجسم المضاد CD34 لكل أنبوب واحتضان الأنابيب في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

ثم أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على DAPI وجهاز الطرد المركزي لمدة ثماني دقائق عند 320 جم في درجة حرارة الغرفة. بعد إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على DAPI ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر قبل الفرز. بعد ذلك ، أضف 0.5 ميكرولتر من الجسم المضاد CD34 إلى قطرة واحدة من الخرز في 100 ميكرولتر من PBS.

احتضن الخليط في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم أضف ملليلتر واحد من PBS إلى الخليط. جهاز طرد مركزي لمدة ثماني دقائق عند 320 جم في درجة حرارة الغرفة.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS. بعد ذلك ، أضف خلايا سرطان الدم السلبية GFP وإيجابية GFP إلى أنبوب FACS. اغسل الخلايا في مليلتر واحد من المخزن المؤقت FACS.

بعد الطرد المركزي للخلايا ، قم بإعادة تعليق 100،000 خلية سلبية GFP و 100،000 خلية إيجابية GFP ، كل منها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر قبل الفرز. ثم اجمع الخلايا المصنفة في وسط الخلايا الجذعية.

الطرد المركزي للخلايا لمدة ثماني دقائق عند 320 جم في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من وسائط تمايز الكريات الحمراء. الآن قم بتوزيع مليلتر واحد من الخلايا المعلقة في ثلاثة آبار من صفيحة 24 بئرا.

املأ جميع الآبار الخارجية ب PBS. لتحديث الوسائط ، تأكد من استقرار الخلايا في الجزء السفلي من اللوحة. قم بإمالة اللوحة برفق وإزالة 500 ميكرولتر من الوسائط.

ثم أضف 500 ميكرولتر من وسائط تمايز السيتوكين الحمراء 2X لتحديث اللوحة. في اليوم السادس ، انقل الخلايا إلى صفيحة مكونة من 12 بئرا وأضف ملليلترا واحدا من الوسائط إلى كل بئر للوصول إلى الحجم النهائي البالغ ملليلترا. اجمع 200 ميكرولتر من الخلايا من كل بئر من اللوحة المكونة من 12 بئرا.

استبدل الحجم الذي تمت إزالته ب 250 ميكرولتر من وسائط تمايز الكريات الحمراء 2X. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب تجميع. بعد الطرد المركزي للأنابيب ، أعد تعليق الخلايا المحببة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.

أضف ميكرولتر واحد لكل من الأجسام المضادة CD71 و CD34 و CD235a إلى الأنابيب. ثم أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على DAPI. قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة ثماني دقائق عند 320 جم في درجة حرارة الغرفة.

أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS باستخدام DAPI. قم بتعيين DAPI مقابل المبعثر الجانبي أو SSC لاستبعاد الخلايا الميتة. قم بتعيين ارتفاع SSC مقابل منطقة SSC لاستبعاد التجميعات وتحديد الخلايا الفردية.

قم بتعيين منطقة التشتت الأمامية مقابل SSCA لإزالة الحطام بناء على الحجم. قم بتعيين CD235a مقابل CD71. قم بتعيين CD34 مقابل SSCA.

قم بتشغيل الخرز والخلايا الموجبة ل GFP والخلايا الملطخة ب DAPI. تعويض القراءات وتطبيق التعويض على إعدادات مقياس الخلوي. أظهرت الخلايا الإيجابية CD34 من دم الحبل السري زيادة في الخلايا المبرمجة الإيجابية Annexin V من 14.4٪ في اليوم الرابع إلى 34.2٪ في اليوم 17.

يظهر الرسم البياني الشريطي زيادة كبيرة في النسبة المئوية للخلايا الإيجابية للملحق V بحلول اليوم 17 ، لتصل إلى حوالي 40٪