تقنية السباحة الأفقية على شكل حرف U لإعداد منوية عالية الجودة بمؤشر تجزئة منخفض للحمض النووي

[الراوي] يركز البحث على طريقة لتحسين المنوية ، بهدف تحديد ما إذا كانت تقنية UHS تقدم مزايا في تحضير منوية عالية الجودة مع مؤشر تجزئة DNA منخفض. تم استخدام تقنية الموائع الدقيقة لتحسين اختيار المنوية عالية الجودة مع انخفاض DFI. يتمثل القيد الرئيسي لطريقة UHS في اعتمادها الكبير على قدرة المنوية عالية الجودة على السباحة الذاتية. طريقة UHS ليست مناسبة للمرضى الذين يعانون من المنوية غير المتحركة تماما. يلعب Thigmotaxis دورا مهما في فصل المنوية. يحتوي المدار على شكل حرف U على حدود أطول ، مما يسهل الحركة الحرة للحيوانات المنوية عالية الجودة ، مما يتيح فصلها الكامل عن المنوية غير المتحركة والشوائب والمكونات الأخرى. بالمقارنة مع تقنية DGC ، تتضمن طريقة حارة UHS خطوات تشغيل يدوية أقل لموظفي المختبر ، ولا تخضع المنوية عالية الجودة التي يتم الحصول عليها من خلال طريقة مسار UHS لإجراءات طرد مركزي متكررة ، مما يؤدي إلى انخفاض DFI. للبدء ، أضف 20 ميكرولترا من وسط التسميد إلى طبق التشغيل لإنشاء مسارات على شكل حرف U. امتص 10 ميكرولترات من وسط التسميد بماصة لإنشاء قطرة دائرية عند نقطة البداية اليسرى للمسار على شكل حرف U. باستخدام وسط الإخصاب ، قم بإنشاء قطرتين عازلتين سعة كل منهما 10 ميكرولتر على فترات على طول الجزء الأوسط الأيسر من المسار على شكل حرف U. قم بتوصيل جميع القطرات بوسط التسميد لتشكيل مسار مستمر. استخدم 2.5 ميكرولتر من البولي فينيل بيروليدون ، أو PVP ، لإنشاء شريط طويل من قطرة السائل على الجانب الأيمن من المسار على شكل حرف U. اصنع ست قطرات دقيقة باستخدام وسيط معالجة البويضات على الجانب الأيمن من شريط PVP. أضف سبعة ملليلتر من زيت الاستزراع إلى الطبق ، مع التأكد من أن الزيت يغطي أعلى نقطة من القطرات بالكامل. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية و 6٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل لتحقيق التوازن بعد جمع السائل المنوي ، قم بقياس حجمه باستخدام طريقة الوزن ، مع ضمان الدقة حتى 0.01 ملليلتر. ضع عينة السائل المنوي في بيئة 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة ، وشفطها في ماصة بلاستيكية واسعة التجويف. إذا لم يذوب السائل المنوي في غضون 60 دقيقة ، أضف كمية متساوية من وسط الإخصاب. استنشق الخليط وزفيره بشكل متكرر باستخدام ماصة نقل بلاستيكية يمكن التخلص منها حتى يذوب تماما. قم بقياس قيمة الأس الهيدروجيني للسائل المنوي باستخدام ورق اختبار دقيق للأس الهيدروجيني بنطاق من ستة إلى 10. خذ 10 ميكرولترات من السائل المنوي المسال بالكامل وقم بتقطيره في غرفة العد البقعي. تقييم حركة المنوية في مجال 200X باستخدام المجهر البصري. أضف خمسة ميكرولترات من السائل المنوي إلى القطرة الدقيقة لوسط الإخصاب عند نقطة البداية اليسرى للمسار على شكل حرف U في طبق تشغيل الحقن المجهري. اضبط زاوية وموضع إبرة البويضات وإبرة الحقن تحت العدسة الموضوعية 4X. بعد التحقق من الإعداد ، انقل البويضة المحددة إلى قطرة صغيرة متوسطة معالجة البويضات في طبق تشغيل الحقن المجهري. ضع طبق التشغيل الذي يحتوي على البويضات على المرحلة الساخنة لمشغل المجهر المعد. بعد ضبط التركيز ، قم بخفض إبرة الحقن في شريط PVP لطبق تشغيل الحقن المجهري. حرك إبرة الحقن إلى الشريط الطويل على الجانب الأيمن من المسار على شكل حرف U واستخرج المنوية عالية الجودة. انقل المنوية إلى شريط PVP على الجانب الأيمن وضع المنوية في قاع طبق التشغيل. اضغط برفق على إبرة الحقن في الجزء الأوسط أو السفلي من ذيل المنوية. اسحب إبرة الحقن بسرعة للخلف وخدش المنوية لشل حركتها. الآن ، استنشق المنوية من الذيل إلى الرأس في إبرة الحقن. حقن المنوية ببطء في سيتوبلازم البويضة ، واحتضان البويضة المحقونة. أضف 1.5 مل من محلول الطرد المركزي المتدرج الكثافة بنسبة 45٪ إلى أنبوب اختبار سفلي مخروطي معقم سعة 15 مل. وأضف ببطء 1.5 مل من محلول الطرد المركزي المتدرج الكثافة بنسبة 90٪ إلى الجزء السفلي من محلول التدرج بنسبة 45٪. الآن ، أضف السائل المنوي المسال إلى محلول الطرد المركزي المتدرج ، وقم بتدوير الأنبوب عند 300 جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المادة الطافية ، اجمع ما يقرب من 0.5 مل من رواسب المنوية المتبقية واخلطها مع ثلاثة ملليلتر من وسط الإخصاب. الطرد المركزي الخليط على حرارة 200 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإخراج المادة الطافية بعناية ، مع ترك ما يقرب من 0.2 مل من الرواسب ، ثم رجها واخلطها لإعادة تعليق الرواسب. أخيرا ، احسب تركيز المنوية وحركتها قبل تخزين العينة في 37 درجة مئوية ، حاضنة ثاني أكسيد الكربون 6٪ لاستخدامها لاحقا. ضع أنبوبا يحتوي على 25 ميكرولتر من محلول الاغاروز منخفض نقطة الانصهار في حمام مائي من 90 إلى 100 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين. ثم انقل الأنبوب إلى حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق حتى تستقر درجة الحرارة. أضف ثلاثة إلى 10 ميكرولترات من السائل المنوي إلى أنابيب الاغاروز ذات نقطة الانصهار المنخفضة واخلطها جيدا. ضع 30 ميكرولترا من الخليط على شريحة زجاجية معالجة مسبقا في وضع أفقي. بعد التغطية ، ضع الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا في الثلاجة على درجة حرارة درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة أربع دقائق ، مع التأكد من بقائها في وضع أفقي. أخرج الشريحة من الثلاجة ، ثم حرك برفق من زجاج الغطاء. اغمر الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا بسرعة في محلول تغيير الطبيعة لمدة سبع دقائق. قم بإزالة الشريحة واجعلها تقف في وضع مستقيم. ثم استخدم ورق الترشيح لامتصاص قطرات الماء الزائدة دون لمس منطقة العينة. اغسل الشريحة بالماء المقطر لمدة خمس ثوان. اغمر الشريحة الزجاجية بشكل متسلسل في الحلول المناسبة للفترة المحددة. ثم احتفظ بالشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا أفقيا ، أضف حوالي ملليلتر واحد من محلول الصبغة المختلط على الشريحة. بعد تلطيخ لمدة خمس دقائق ، اشطف شريحة الزجاج الملون برفق بالماء المقطر من 10 إلى 15 مرة. سبحت المنوية عالية الجودة ذات الحركة التقدمية الجيدة بسلاسة على طول حافة المسار على شكل حرف U ، مما يسهل على إبرة حقن المنوية داخل الهيولى الإمساك بها بشكل فردي. بينما تم الحصول على منوية جيدة باستخدام كلتا الطريقتين ، كان مؤشر تجزئة الحمض النووي للحيوانات المنوية عالية الجودة المنفصلة باستخدام طريقة الطرد المركزي المتدرج الكثافة أعلى بكثير مقارنة بطريقة السباحة الأفقية على شكل حرف U.