عزل الخلايا الغضروفية والغضروفات باستخدام التصاق الفيبرونيكتين ومقايسة الهجرة

في مجال هندسة أنسجة الغضاريف والطب التجديدي ، لا تزال هناك حاجة لتعزيز النتائج البيولوجية والوظيفية من حيث تحسين العلاج المستمر وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة. تشير الأبحاث قبل السريرية الحالية إلى الاستخدام المحتمل للغضروف المنشأ المشتق من الغضروف كخيار قابل للتطبيق لشفاء الغضاريف. تتضمن الأبحاث الحالية استراتيجيات لزيادة تعزيز إمكانات الغضروف مع الحفاظ على فاعلية تضخمية أقل من خلال استخدام عوامل نمو إضافية وتقنيات مؤتلفة الجينات.

تواجه الغضروفات تحديات تجريبية ، بما في ذلك عدم وجود توافق في الآراء حول التسمية ، وتقنيات العزل المتنوعة ، وصعوبات التوصيف ، والتباين في ظروف الثقافة ، والفهم المحدود للآليات الأساسية. إن إثبات أن الأمراض الغضروفية المنشأة سريريا تؤدي إلى نتائج إيجابية مقارنة بالخلايا شائعة الاستخدام يمكن أن يقلل بشكل كبير من العبء العالمي المرتبط بالأمراض المرتبطة بالغضاريف. تطور العلاجات المحسنة باستخدام بدائل خالية من الخلايا ، مثل الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الأسلاف ، واستخدام استراتيجيات مؤتلفة لتجديد الغضروف الأصلي الشبيه بالهيالين.

للبدء ، احصل على مفاصل الظنبوبة الفخذية أو الركبة من المتبرعين البشريين في 1X PBS في ظل ظروف معقمة ، ثم انقل المفاصل المحصودة إلى الوسادة السفلية المعقمة في الغطاء. لتثبيت المفاصل ، أمسك العظم تحت الغضروف بحيث يكون الغضروف متجها لأعلى. باستخدام شفرة مشرط رقم 22 ، قم بحصاد نشارة الغضروف المستطيلة الشكل من المناطق غير الحاملة للوزن.

قطع الغضروف إلى أقسام بقياس ثمانية ملليمترات × 10 ملليمترات من الطبقة السطحية إلى الطبقة الأعمق. بعد غسل الشرائح باستخدام PBS ، ضعيها في طبق بتري يحتوي على مل إلى ملليلتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco العادي ، أو DMEM. بعد ذلك ، باستخدام شفرة مشرط رقم 22 ، قم بفرم شرائح الغضروف إلى حجم أصغر من مليمتر واحد مكعب.

للبدء ، احصل على غضروف مفروم من مفاصل الركبة البشرية المستخرجة. ضع الغضروف المفروم في قارورة T25 منتصبة تحتوي على 10 مل من DMEM / F-12 الخالي من المصل مع 0.15٪ كولاجيناز من النوع الثاني للهضم الأنزيمي. اترك القارورة دون إزعاج في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 إلى 14 ساعة.

بعد الهضم طوال الليل ، انقل الوسط الذي يحتوي على الخلايا الغضروفية المنبعثة إلى أنبوب طرد مركزي معقم جديد. استخدم مصفاة خلوية لفصل الخلايا عن الحطام. أضف حجما متساويا من DMEM/F-12 مع مصل بقري الجنين بنسبة 10٪، أو FBS.

الطرد المركزي للخلايا المفلترة عند 1 ، 200 جم لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تكوين الحبيبات في مليلتر واحد من المتوسط. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقايسة استبعاد trypan blue.

بعد ذلك ، قم بتحميل الخلايا الغضروفية في قارورة T25 بتركيز 10 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع. قم بتوسيع الخلايا إلى رقم المرور المطلوب باستخدام DMEM/F-12 الذي يحتوي على 10٪ FBS. قم بتحديث الوسط كل ثلاثة أيام قبل حصاد الخلايا عند التقاء فرعي باستخدام 0.125٪ تريبسين يحتوي على EDTA.

تلتصقت الخلايا الغضروفية على الفور بعد التحميل وانتقلت من شكل مرصوف بالحصى المستدير إلى مظهر الخلايا الليفية أثناء توسعها. للبدء ، احصل على نشارة الغضروف من مفاصل الظنبوب الفخذي أو الركبة البشرية المستخرجة. أخضع نشارة الغضروف للهضم الأنزيمي المتسلسل طوال الليل ، أولا باستخدام 0.2٪ بروناز لمدة ثلاث ساعات ، متبوعا بنسبة 0.04٪ من النوع الثاني من الكولاجيناز لمدة 12 ساعة في حمام مائي مهتز يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بتغطية العدد المطلوب من الآبار من صفيحة مكونة من ستة آبار ب 1.5 مل من محلول فيبرونيكتين PBS. أغلق الطبق بإحكام وضعه في الثلاجة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة الصفيحة المكونة من ستة آبار مغطاة بالفبرونكتين من الثلاجة.

بعد إزالة الفيبرونكتين الزائد ، أضف ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من وسط DMEM / F-12 العادي في الآبار المطلية. قم بزرع الخلايا الغضروفية المنبعثة على الآبار المطلية بكثافة 4 ، 000 خلية لكل بئر واترك الصفيحة دون إزعاج لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، استنشق الوسائط الزائدة والخلايا غير الملتصقة.

أضف ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من DMEM / F-12 مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ إلى الآبار. حافظ على الخلايا الملتصقة في ظل ظروف الاستزراع القياسية لمدة 10 إلى 12 يوما للحصول على استنساخ الخلية السلفية الغضرورية ، أو CPC ، ثم عزل استنساخ CPC باستخدام 0.125٪ تريبسين EDTA لمدة 180 ثانية ، ثم أعد التشغيل بنسبة استنساخ واحد لكل خمسة سنتيمترات مربعة. قم بتوسيع CPCs متعددة النسيلة المخصبة إلى التقاء المطلوب.

تظهر الخلايا الغضروفية التي تعرضت لمقايسة التصاق الفيبرونيكتين نموا نسيليا ، حيث يصل عدد السكان إلى مضاعفة خمسة بحلول اليوم 10. للبدء ، احصل على استخلاص الغضروف المحلوق من المفصل المفصلي المحصود في وسط DMEM / F-12 الكامل. ضع اللوحة مع النباتات داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون مثبتة على 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

بعد يومين ، انقل النباتات إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 10 مل من محلول الكولاجيناز 0.1٪ للهضم الأنزيمي. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد الهضم ، اشطف النباتات الخارجية باستخدام 1X PBS وأعدها إلى نفس الآبار في اللوحة التي تحتوي على وسط DMEM / F-12 الطازج.

احتفظ باللوحة في الحاضنة في ظل ظروف الاستزراع القياسية وراقب هجرة الغضروفات خلال الأيام اللاحقة. بمجرد أن تصل النباتات إلى التقاء فرعي ، قم بحصاد خلايا غضروف اللحمة المتوسطة ، أو MCPs ، باستخدام محلول 0.125٪ تريبسين EDTA. قم بتوسيع MCPs باستخدام وسيط DMEM / F-12 التكميلي.

تبدأ الغضروفات في الهجرة من حافة النبتة بحلول اليوم 10 من الثقافة ، وتظهر نمط نمو على شكل مغزل مع مزيد من التوسع.