القياس الكمي لتنفس الميتوكوندريا في خلايا الخميرة الكاملة

يعد تنفس الميتوكوندريا مولدا رئيسيا للطاقة الخلوية في معظم الظروف ، ومؤشرا مهما على التمثيل الغذائي الخلوي واللياقة البدنية. وبالتالي ، تحدد وظائف الميتوكوندريا الحالة الخلوية للطاقة الحيوية. يصف هذا البروتوكول تقنية لقياس تنفس الميتوكوندريا في الخلايا الحية G كمعامل للطاقة الحيوية.

تساعدنا التقنية الموضحة في هذا البروتوكول في تحديد آلية الطاقة الحيوية لبعض البوليفينول، مثل الريسفيراترول والكورسيتين. كما أنها بمثابة أداة لقياس التمثيل الغذائي البنتوز ، وكذلك من PTSPTs وشرح التغير في الطاقة الحيوية خلف شجرة الكابينة وتأثيرات العمل الأرضي. نحن مهتمون بفك رموز كيفية اكتساب الخلايا لبعض الأنماط الظاهرية ، مثل شجرة الكابينة وتأثيرات العمل الأرضي ، مع تغييرات كبيرة في الطاقة الحيوية الخلوية.

يعد تنفس الميتوكوندريا أداة أساسية لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الظواهر الأيضية. للبدء ، قم بتلقيح أنبوب اختبار زجاجي سعة 10 مليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط YPD مع 250 ميكرولتر من خلايا الخميرة المحفوظة بالجلسرين. احتضان أنبوب الاختبار طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع تحريك مستمر بمعدل 200 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، باستخدام حلقة معقمة ، قم بربط لوحة مثقاب YPD مع خلايا الخميرة المزروعة في أنبوب اختبار زجاجي سعة 10 مل. احتضان طبق بتري عند 30 درجة مئوية حتى تظهر مستعمرات معزولة. لتحضير اللقاح المسبق ، قم بتلقيح ثلاثة ملليلتر من وسط YPD بنسبة 2٪ جلوكوز مع مستعمرتين أو ثلاث مستعمرات خميرة معزولة واحتضنها.

ثم احصل على 100 مل من الوسط الاصطناعي الكامل المعقم في قارورة Erlenmeyer سعة 500 مل. تلقيح الوسائط بثقافة الخميرة قبل التلقيح الليلية بكثافة بصرية أولية تبلغ 0.1 عند 600 نانومتر. أضف التحدي الكيميائي مثل 100 ميكرومولار ريسفيراترول لاختبار تنفس الميتوكوندريا.

بعد ذلك ، اسكب خلايا الطور اللوغاريتمي في أنبوب مخروطي فارغ ووزنه مسبقا 15 مليلتر ، وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 4 ، 000 جم لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، اغسل الحبيبات ثلاث مرات ب 25 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بوزن الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الحبيبات المغسولة للحصول على الوزن الرطب عن طريق طرح وزن الأنبوب الفارغ.

ثم أعد تعليق الحبيبات المغسولة في ملليلترين من الماء منزوع الأيونات. للبدء ، احصل على خلايا الخميرة المعالجة بالأدوية المناسبة ، مثل الريسفيراترول. ضع خمسة ملليلتر من 10 ملليمولار MES-TEA و 50 ملليغرام من الخلايا الرطبة في غرفة الكسب غير المشروع القطبية.

ضع قطب الأكسجين من نوع كلارك برفق ، مع التأكد من عدم تكوين فقاعات. قم بتشغيل شاشة YSI 5300A وكمبيوتر الحصول على البيانات. حدد قرص إعداد القناة الأولى للهواء، واضبط القناة الأولى على 100٪ باستخدام قرص معايرة القناة الأولى.

ابدأ في تسجيل البيانات وابدأ في قياس الوقت باستخدام الكرونومتر. باستخدام حقنة كروماتوغرافيا ، أضف الركيزة القابلة للأكسدة إلى التركيز النهائي البالغ 10 مللي مولار ، واحتفف بالغرفة مغلقة مع تحريض مستمر. بعد ذلك ، باستخدام حقنة كروماتوغرافيا ، أضف oligo mycin للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.01 ملليمولار في غرفة مقياس التأكسج وتسجيل استهلاك النسبة المئوية للهواء.

وبالمثل ، أضف CCCP إلى التركيز النهائي البالغ 0.015 ملليمولار في غرفة مقياس التأكسج لتحديد قدرة التنفس القصوى. بعد ذلك ، أضف مثبطات سلسلة نقل الإلكترون ، ثلاثي فلوروسيتون الأسنان والزيت ، أو TTTFA ، عند ملليمولية واحدة ، متبوعا بمضادات الميسين أ بمعدل واحد ملليغرام لكل مليلتر. اغسل الغرفة ثلاث مرات لكل منها بنسبة 70٪ من الإيثانول ، متبوعا بالماء منزوع الأيونات ، قبل الانتقال إلى مصدر الكربون التالي.

للبدء ، قم بإجراء فحص استهلاك الأكسجين مع خلايا الخميرة ، باستخدام مصادر وضوابط كربون مختلفة. قم بإنشاء ملف مشروع جديد في البرنامج الإحصائي واختر XY في قسم الإنشاء. ثم حدد إدخال البيانات أو استيرادها إلى جدول جديد في قسم جدول البيانات.

في قسم الخيارات، حدد الأرقام في القسم الفرعي X وفي القسم الفرعي Y. انقر فوق إدخال ثلاث قيم متماثلة في أعمدة فرعية جنبا إلى جنب. أدخل بيانات الوقت في الأعمدة X وأدخل بيانات النسبة المئوية للهواء في الأعمدة Y.

لإجراء تحليل انحدار خطي ، انقر فوق تحليل في شريط القائمة وتحت التحليل ، حدد الانحدار الخطي البسيط في تحليل XY ، ثم انقر فوق موافق. احصل على قيمة الميل من قسم النتائج في جداول البيانات. انسخ قيم الميل المحسوبة في ورقة بيانات.

اطرح قيمة المنحدر التي تم الحصول عليها من مزيج مثبطات الجهاز التنفسي من تلك الموجودة في الركيزة القابلة للأكسدة ، oligomycin ، و CCCP للتخلص من مصادر استهلاك الأكسجين الأخرى. الآن ، اضرب قيم الميل في 237 ميكرومولار من الأكسجين ، وهو ما يمثل قابلية ذوبان الأكسجين في هذه الحالة ، والمخزن المؤقت. قم بتحويل القيم إلى ميكرومولار من الأكسجين في الدقيقة ، مع الضبط وفقا لكيفية رسم الوقت.

اقسم النتائج على 50 ، أي ما يمثل ملليغرام الخلايا المستخدمة في التجربة. أخيرا ، يتم التعبير عن استهلاك الأكسجين على أنه ميكرومولار من الأكسجين لكل مليغرام من الخلايا في الدقيقة. أظهرت الخلايا المزروعة في 0.5٪ جلوكوز استهلاكا أعلى بكثير للأكسجين في التنفس القاعدي ، والتنفس المرتبط ب ATP ، والقدرة التنفسية القصوى ، مقارنة بتلك التي نمت في 5٪ جلوكوز.

قلل الكيرسيتين بشكل كبير من تنفس الميتوكوندريا في الخلايا المزروعة بنسبة 0.5٪ جلوكوز ، مما أثر على التنفس القاعدي والمرتبط ب ATP والحد الأقصى. من ناحية أخرى ، لم يؤثر الكيرسيتين بشكل كبير على تنفس الميتوكوندريا في الخلايا ، التي تنمو في 5٪ جلوكوز.