تقنية محسنة ومبسطة لإنتاج واستزراع شرائح الكبد المقطوعة بدقة

يمكن أن تختلف بروتوكولات إنتاج وزراعة شرائح الكبد المقطوعة بدقة ، أو PCLS ، بشكل كبير. العيب الرئيسي ل PCLS هو نصف عمرها القصير ، ولكن هنا ، نثبت أنه يمكن تحقيق إنتاج وزراعة PCLS في ظروف المختبر القياسية مع الوصول إلى Vibratome مع ضمان عمر نصف لا يقل عن أربعة أيام. PCLS ، نموذج جذاب يملأ الفجوات بين نماذج المختبر و in vivo ، ولكن غالبا ما يتم إهمالها بسبب نصف عمرها القصير نسبيا. ومع ذلك ، فهي تحتوي على جميع أنواع الخلايا وبنية محفوظة ، ضرورية لجمع التمثيل الغذائي ، وبالتالي تشبه نموذجا صغيرا للعضو بأكمله ، مما يتيح دراسة وعلاج الأنسجة الحية مع تكرار أنماطها الظاهرية المعقدة. الشرائح المستمرة هي عملية بسيطة للغاية ولكنها صعبة من الناحية الفنية. لتسهيل ذلك ، يركز بروتوكولنا على الخطوات الرئيسية ، مثل اتجاه القطع ، وتضمين الأنسجة ، ولكن أيضا أهمية حجم النموذج المصغر للثقافة والنظام الديناميكي لزيادة نصف عمرها.

[الراوي] قبل الحصاد ، قم بإعداد لترا واحدا من مخزن Krebs-Henseleit المؤقت ، وصينية Vibratome مطهرة ومبردة ، وشفرات Vibratome معقمة ، و 4٪ من الاغاروز منخفض الذوبان. في يوم الحصاد ، احتفظ بالأغاروز المذاب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. بعد ذلك ، قم بإعداد ألواح الاستزراع عن طريق إضافة 2.6 و 1.5 و 0.7 مل من الوسائط الكاملة لكل بئر في ستة و 12 و 24 بئرا على التوالي. أدخل إدخالات مسامية بحجم ثمانية ميكرومتر في كل بئر. ضع الألواح في حاضنة رطبة مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ أكسجين. تعقيم جميع الأدوات اللازمة للحصاد باستخدام طرق التعقيم المناسبة. رش بطن الفأر القتل رحيم بنسبة 70٪ من الإيثانول لتطهير المنطقة. باستخدام ملقط ومقص معقم ، قم بقطع الجلد والصفاق من منتصف البطن لفتح تجويف البطن. قم بتشريح الكبد برفق من الأعضاء أو الأوعية المحيطة مع تجنب تلف الفصوص. بعد ذلك ، قم بتخزين الكبد بالكامل على الفور في عازلة كريبس المثلجة. باستخدام ملقط غير حاد وسكين أو مقص حاد ومعقم ، افصل كل فص على حدة لتجنب إتلاف الفصوص أثناء الفصل. باستخدام سكين حاد ومعقم ، قم بقص جميع حواف الفص المختار لإنشاء حواف مستقيمة يمكن التحكم فيها للتضمين. بعد ذلك ، اسكب الاغاروز منخفض الذوبان بنسبة 4٪ في طبق بتري بطول ثلاثة سنتيمترات يوضع على الثلج الرطب ليبرد بالتساوي ويمنع الفص من الغرق. اترك الاغاروز ليبرد لمدة 30 ثانية أخرى ، وضع الفص المشذب في وسط الاغاروز ، مما يسمح له بالاستقرار في منتصف الكتلة. ثم قم بقطع الحواف الخارجية لكتلة الاغاروز وإزالة كتلة الاغاروز من الطبق. تأكد من أن الجانب العلوي والجانب الملتصق بمنصة Vibratome متوازيان للحافة العلوية للفص. ابدأ بضبط Vibratome على القطع بسمك 250 ميكرومتر بسرعة خمسة وتردد سبعة هرتز. بعد تعقيم الاهتزاز ووضع الدرج على الاهتزاز ، أحيطه بالثلج للحفاظ على برودة البيئة. اضبط الشفرات بزاوية 10 درجات لأسفل من المستوى الأفقي. ثم املأ خزان Vibratome بمخزن Krebs المثلج. ضع طبقة رقيقة من غراء سيانواكريليت على المنصة لإعدادها لتركيب كتلة الاغاروز. بعد ذلك ، جفف حافة كتلة الاغاروز التي سيتم لصقها على المنصة باستخدام أنسجة ماصة معقمة. الآن ، ضع كتلة agarose على منصة Vibratome القابلة للإزالة. ضع فص الكبد في وضع مستقيم للسماح بقطع عرضية ، مما يقلل الضغط على الفص ويسهل القطع بشكل أكثر سلاسة. انتظر دقيقة واحدة حتى يتم تثبيت الغراء وغمره في خزان Vibratome ، مما يضمن تغطية كتلة الاغاروز بالكامل بمخزن Krebs المؤقت. لبرمجة الاهتزاز للقطع ، اضبط موضعي البداية والإيقاف. ثم ابدأ في تقطيع الشرائح حتى يتم الوصول إلى فص الكبد. استخدم ملعقة لجمع شرائح الكبد ، لأن هذا يتجنب التلف ، على عكس الملقط أو الفرش. اجمع الشرائح في عازلة كريبس المثلجة حتى تصبح جاهزة للثقافة. باستخدام ملعقة ، انقل شرائح الكبد إلى الآبار المحضرة التي تحتوي على وسائط وإدخالات. بعد ذلك ، ضع الألواح على شاكر مداري مضبوطة على 130 دورة في الدقيقة واحتضانها في حاضنة زراعة الخلايا التقليدية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ أكسجين.