تطوير نموذج الأغشية الحيوية للمستعمرة متعددة الميكروبات لاختبار مضادات الميكروبات في التليف الكيسي

ركز بحثنا على استخدام نماذج متعددة الميكروبات المعقدة لفهم التفاعلات المعقدة بين الميكروبات في بيئة التليف الكيسي وكيف يؤدي ذلك إلى زيادة تحمل مضادات الميكروبات. نأمل في استخدام هذه المعرفة لتطوير تدخلات علاجية جديدة. يتم دفع التطورات في مجال الأغشية الحيوية من خلال التصور ، إلى جانب منهجيات القياس الكمي جنبا إلى جنب مع الأساليب الفيزيائية الحيوية.

يتضمن ذلك تقنيات مثل 3D OrbiSIMS التي تعطي الدقة المكانية وصولا إلى المقياس الجزئي والنانوي. يهدف هذا البحث إلى إنشاء نموذج متعدد الميكروبات يحافظ على مستوى من التعقيد ، يمثل ما يظهر في علاجات المضادات الحيوية في مرضى التليف الكيسي. كما سيسمح بزيادة الإنتاجية ، ومخرجات أكثر صلة والقدرة على التكيف مع السلالات والظروف الأخرى.

يوفر هذا البروتوكول بيئة اختبار ذات صلة لمسببات أمراض التليف الكيسي. إنه قوي وله إنتاجية عالية نسبيا. كما أنه قابل لنقاط نهاية متعددة ، مما يسمح بإجراء دراسات أكثر تعقيدا.

أظهر هذا البحث أن البيئة ذات الصلة بالتليف الكيسي تتغير وقابلية الميكروبات للتأثر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يغير نوع الفطريات الموجودة أيضا قابلية الإصابة ب Pseudomonas aeruginosa ، وقد يكون لهذا صلة سريرية كبيرة. للبدء ، خذ مزارع الزائفة الزنجارية ، والمكورات العنقودية الذهبية ، والمبيضات البيضاء التي نمت إلى المرحلة الأسية.

باستخدام ماصة دقيقة، انقل ملليلتر واحد من كل مزرعة سائلة إلى أنبوب معقم منفصل سعة 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي الأنابيب لمدة دقيقتين عند 8 ، 000 × جم لحبيبات البكتيريا أو الفطريات. بعد ذلك ، باستخدام ماصة ، قم بشفط المادة الطافية من كل أنبوب وأعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من PBS.

تمييع الخلايا الزائفة الزنجارية المعلقة ، والمكورات العنقودية الذهبية من واحد إلى 10 في PBS. ثم باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس الكثافة الضوئية بطول موجي يبلغ 600 نانومتر. بعد تخفيف العينات المغسولة من المبيضات البيضاء من واحد إلى 100 في PBS ، قم بتقطيع 10 ميكرولتر من كل عينة إلى غرفتين فرديتين لمقياس كثافة الدم.

ثم اضبط عينة المبيضات البيضاء إلى 1 × 10 إلى قوة ثمانية CFU لكل مليلتر في PBS. لتحضير اللقاح لإضافته إلى الأغشية الحيوية ، اضبط Pseudomonas aeruginosa و Candida albicans و Staphylococcus aureus inoculum باستخدام PBS. بالنسبة للأغشية الحيوية أحادية النوع ، ضع ماصة 10 ميكرولتر من الميكروب المخفف على مركز قرص من البولي كربونات يوضع على SCFM2 1.5٪ أجار تقني في ألواح ذات 6 آبار.

احتضان اللوحة بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل العلاج أو التعطيل. بالنسبة للأغشية الحيوية متعددة الميكروبات ، أضف 10 ميكرولتر من كل من المكورات العنقودية الذهبية والمبيضات البيضاء فوق بعضهما البعض على نفس قرص البولي كربونات. احتضان القرص الملقح بشكل ثابت لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة باستخدام ملقط معقم ، قم بنقل أقراص البولي كربونات إلى ألواح أجار تقنية SCFM2 1.5٪ جديدة. أضف 10 ميكرولترات من 1 × 10 إلى قوة أربعة CFU لكل ملليلتر تخفيف من Pseudomonas aeruginosa فوق المكورات العنقودية الذهبية المنشأة مسبقا ، المبيضات البيضاء الأغشية الحيوية. احتضن لمدة 24 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية.

للبدء ، خذ الأغشية الحيوية لمستعمرة واجهة الهواء الصلب من Pseudomonas aeruginosa و Staphylococcus aureus و Candida albicans. أضف حبات السيراميك بقطر 2.8 ملم إلى اللوحة وربط الأشعة فوق البنفسجية باللوحة. باستخدام ملقط معقم باللهب ، انقل خمسة حبات خزفية إلى أنبوب خالط معقم سعة ملليلتر.

ماصة مليلتر واحد من PBS في أنبوب التجانس المليلتر. دوامة الأنابيب لمدة 10 ثوان على الأقل أو حتى تتم إزالة الأغشية الحيوية من قرص البولي كربونات على النحو الذي يحدده الفحص البصري. بمجرد إزالته ، أخرج قرص البولي كربونات ، ثم ضع الأنابيب مع الخرزات في الخالط واضربها مرتين لمدة 10 ثوان بسرعة ستة أمتار في الثانية مع فاصل عشر ثوان بين النبضات.

الآن صب الأغشية الحيوية المعطلة من أنبوب الخالط في سبعة ملليلتر بيجو تحتوي على أربعة ملليلتر من PBS مما ينتج عنه حجم نهائي يبلغ خمسة ملليلتر. الطرد المركزي أنابيب الخالط عند 8 ، 000 × جم لمدة دقيقتين. ثم انقل السائل المتبقي إلى سبعة ملليلتر بيجو لضمان نقل كل السائل.

أضف 200 ميكرولتر من الأغشية الحيوية المعطلة إلى صفيحة سوداء ذات قاع شفاف سعة 96 بئرا ، ثم قم بإدخال 10 ميكرولتر من محلول ريزازورين 0.02٪ في كل بئر. احتضان الأغشية الحيوية المعالجة بالريزازورين في قارئ لوحة عند 37 درجة مئوية. ضع الاهتزاز المداري كل 30 دقيقة لمدة 10 ثوان عند 200 دورة في الدقيقة قبل أخذ أي قراءات فلورسنت.

قم بقياس التألق باستخدام طول موجة إثارة يبلغ 540 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 590 نانومتر. تطلبت الأغشية الحيوية أحادية النوع تركيزات أقل بكثير من الميروبينيم والتوبرامايسين لتحقيق قتل بنسبة 50٪ مقارنة بالأغشية الحيوية متعددة الميكروبات مع زيادة لوغاريتمينية في تركيز المضادات الحيوية اللازمة لهذا الأخير. زاد بقاء Pseudomonas aeruginosa في الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات مع 64 ميكروغراما لكل مليلتر من التوبراميسين ، بينما أظهر meropenem انخفاضا في البقاء على قيد الحياة في ظل ظروف مماثلة.

في الأغشية الحيوية أحادية النوع ، لوحظ وجود علاقة قوية بين بقاء Pseudomonas aeruginosa ونشاطها الأيضي عند معالجته بكل من meropenam و tobramycin.