تحسين تحضير المستضد لمقايسة تثبيط التخثر الدموي لعلم مصل فيروس مرض نيوكاسل

يركز بحثنا على تحسين تحضير المستضد لمقايسات تثبيط الدم. لتحسين دقة الكشف عن الأجسام المضادة NDV ، نقدم طريقة للتحضير السريع والدقيق لمحلول مستضد 4-HAU. يظل اختبار HI هو الطريقة الأكثر شيوعا للكشف عن الأجسام المضادة NDV.

ومع ذلك ، يمكن أيضا دمج التقنيات الجديدة ، بما في ذلك أنظمة معالجة السوائل الآلية ، والمنصات المصلية عالية الإنتاجية ، وأدوات التصوير المتقدمة في اختبار HI. إنها تتيح تحليلا أسرع وأكثر دقة ، خاصة عند التعامل مع أحجام الدفعات الكبيرة. لقد أنشأنا طريقة فعالة للكشف الأكثر دقة عن عيارات HA لمحلول مخزون المستضد، جنبا إلى جنب مع طريقة صارمة للمعايرة بالتحليل الحجمي الخلفي وعملية ضبط محددة جيدا.

يوفر هذا النهج طريقة دقيقة ويقلل من المهام الحسابية ، ويزيد من كفاءة الاختبار وموثوق بها ، ويساهم في تحسين مراقبة الأمراض ومكافحتها في مجموعات الدواجن. لا يزال تعليق خلايا الدم الحمراء للدجاج والقراءة المرئية لنتائج HA HI يساهم في التباين. سيركز مختبرنا على توحيد تعليق كرات الدم الحمراء واستكشاف رؤية الكمبيوتر أو طرق أخرى لرقمنة نتائج فحص HA HI ، وتقليل الذاتية وتعزيز الاتساق.

للبدء ، أضف ثلاثة ملليلتر من محلول Alserver في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل. اجمع ملليلترا واحدا من الدم من الوريد الجناحي لكل من الدجاجات الثلاثة غير المحصنة. بعد ذلك ، انقل الدم الذي تم جمعه على الفور إلى الأنبوب المضاد للتخثر واخلط المحتويات برفق عن طريق الانعكاس.

املأ الأنبوب ب PBS معقم ليصل الحجم الإجمالي إلى 12 ملليلترا. امزج المحلول برفق لضمان التوزيع المتساوي للمكونات. بعد ذلك ، ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي مزود بدوار أفقي وجهاز طرد مركزي عند 500 جم لمدة 10 دقائق.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وطبقة خلايا الدم البيضاء بعناية من الأنبوب. باستخدام ماصة، قم بعكس ماصة ملليلتر واحد من حبيبات كرات الدم الحمراء إلى 99 مل من محلول PBS المعقم لتحضير معلق كرات الدم الحمراء بنسبة 1٪. لإعادة تكوين المستضد المجفف بالتجميد ، أضف ملليلترين من PBS المعقم إلى الأمبولة التي تحتوي عليه.

رج الأمبولة برفق لإذابة المحتويات تماما واتركها لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لتقليل تكوين الفقاعات. أعيد تشكيل المحلول في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مليلتر وتخزينه في ثلاجة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. للبدء ، قم بتوزيع 40 و 80 و 120 و 160 ميكرولترا من PBS على التوالي في أربعة آبار متجاورة من لوحة ميكروتيتر قاع على شكل حرف V يمكن التخلص منها 96 بئرا.

أضف 20 ميكرولترا من المستضد المعاد تكوينه إلى كل بئر وقم برفع وهبوط الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لخلق التخفيف. بعد ذلك ، قم بتسمية لوحة ميكروتيتر جديدة بوضوح للخطوات اللاحقة ، وقم بتوزيع 25 ميكرولترا من PBS في كل بئر في صفوف من واحد إلى خمسة. باستخدام ماصة متعددة القنوات، ضع 25 ميكرولترا من محاليل المستضد المخففة في الآبار الأولى من الصفوف من واحد إلى خمسة.

قم بعرض المحتويات لأعلى ولأسفل خمس مرات على الأقل لضمان التوزيع المنتظم. ثم انقل 25 ميكرولترا من البئر الأول من كل صف إلى البئر الثاني ، واخلطه جيدا. تخلص من 25 ميكرولترا من المحلول النهائي بعد العمود الحادي عشر.

بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من PBS و 1٪ معلق كرات الدم الحمراء للدجاج على التوالي إلى كل بئر ، بدءا من الآبار التي تحتوي على أقل تركيز للمستضد. ضع لوح الميكروتيتر على شاكر الصفيحة الدقيقة لخلطها جيدا. اترك اللوحة دون إزعاج على سطح الطاولة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا للسماح لكرات الدم الحمراء في العمود 12 بالاستقرار تماما.

احسب عامل التخفيف لتحضير محلول مستضد 4-HAU باستخدام الصيغة الموضحة هنا. حدد الحجم الإجمالي لمحلول 4-HAU المطلوب والأحجام المطلوبة لمحلول مخزون المستضد و PBS باستخدام الصيغة المحددة. باستخدام ماصة، انقل الحجم المحسوب ل PBS إلى حاوية.

أضف الحجم المقابل لمحلول مخزون المستضد واخلطه جيدا لتحضير محلول مستضد 4-HAU. بعد ذلك ، قم بتوزيع 25 و 50 و 75 و 100 و 125 و 150 ميكرولتر من PBS في ستة آبار متجاورة من صفيحة ميكروتيتر. أضف 25 ميكرولترا من محلول مستضد 4-HAU إلى كل بئر، وقم برفع الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لضمان التخفيف المناسب.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل 25 ميكرولترا من كل محلول مستضد مخفف من الصف الأولي إلى آبار صف آخر. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من PBS إلى كل بئر ، متبوعا ب 25 ميكرولترا من معلق كرات الدم الحمراء للدجاج بنسبة 1٪ في كل بئر. ضع الطبق على شاكر دقيق لمدة 20 ثانية تقريبا لخلط المحتويات جيدا.

راقب بعناية أنماط التضخم الدموي في الآبار ، وسجل النتائج.