مراقبة التغيرات الناجمة عن التثقيب الكهربائي في توليد جهد الفعل في خلايا ارتفاع HEK المعدلة وراثيا

يزيد التثقيب الكهربائي مؤقتا من نفاذية غشاء الخلية عن طريق نبضات كهربائية عالية الجهد. هناك العديد من العلاجات السريرية سريعة التطور القائمة على التثقيب الكهربائي التي تستهدف الخلايا العضلية والعصبية. لذلك من الأهمية بمكان التحقيق في كيفية تأثير التثقيب الكهربائي على قدرة هذه الخلايا القابلة للاستثارة على تحفيز إمكانات العمل.

تعتبر التجارب في المختبر مهمة جدا لفهم تأثيرات التثقيب الكهربائي على الخلايا القابلة للاستثارة. ومع ذلك ، فإن الخلايا العضلية والخلايا العصبية الأولية لها ملف تعريف تعبير قناة أيونية معقد للغاية مما يجعل من الصعب للغاية فك التفاعل بين الإثارة والتثقيب الكهربائي. قمنا بتطوير بروتوكول لمراقبة التغيرات الناجمة عن التثقيب الكهربائي في توليد جهد الفعل باستخدام خلايا HEK المتصاعدة.

تعبر هذه الخلايا عن الحد الأدنى من قنوات الصوديوم والبوتاسيوم التي تجعلها قابلة للاستثارة. لذلك ، قامت هذه الخلية بتبسيط التجارب والتحليل النظري للنتائج التي تم الحصول عليها. باستخدام بروتوكولنا ، وجدنا أن التثقيب الكهربائي الخفيف جدا يمكن أن يؤثر بالفعل بشكل كبير على قبول الخلية.

ستمهد هذه النتائج الطريق لتطوير نماذج نظرية للتثقيب الكهربائي وقبول الخلايا ، وهذا سيساعد المجتمع على تحسين العلاجات القائمة على التثقيب الكهربائي الناشئة بسرعة في القلب والدماغ وعضلات الهيكل العظمي. للبدء ، قم بإدخال مليلتر واحد من PBS في بئر واحد من شرائح الغرفة الزجاجية ذات الغطاء الجيد. أضف 10 ميكرولتر من محلول بولي إل ليسين المعقم بمقدار ملليغرام واحد لكل مليلتر ، واخلطه جيدا باستخدام ماصة.

احتضن لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في ظروف معقمة في غطاء التدفق الصفحي ، ثم قم بإزالة PBS باستخدام poly-L-lysine دون مزيد من الغسيل. لزرع الخلايا ، قم بإعداد مخفف من واحد إلى 10 من محلول مخزون الدوكسيسيكلين في وسط استزراع في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. الآن ، قم بإزالة وسيط الثقافة من قارورة T-25.

قم بتربسين الخلايا ب 2.5 مل من محلول التربسين EDTA في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. أضف 2.5 مل من وسط الاستزراع الطازج وقم بماصة الخلايا برفق لفصلها عن السطح. احسب حجم معلق الخلية التربسينية اللازم لإنشاء الثقافة.

اطرح حجم تعليق الخلية المحسوب مسبقا من 1 ، 470 ميكرولتر لحساب حجم وسط الاستزراع. لتحضير عينات بخلايا S HEK القابلة للاستثارة، قم بتحويل الحجم المحسوب لوسط الاستزراع وتعليق الخلية التربسينية إلى بئر واحد. أضف 30 ميكرولتر من تخفيف الدوكسيسيكلين.

تخلط جيدا عن طريق الماصة اللطيفة قبل وضع الغرف في حاضنة ثاني أكسيد الكربون مباشرة. لتحضير العينات بخلايا NS HEK غير القابلة للاستثارة ، قم بتقطيع الحجم المحسوب لوسط المزرعة في بئر ، وأضف 90٪ من الحجم المحسوب لتعليق الخلية لخلايا S HEK بدون الدوكسيسيكلين. احتضان الغرف في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام قبل التجربة.

قبل التجربة ، قم بإدخال ثلاثة ميكرولترات من محلول مخزون الصبغة الجهدية في أنبوب سعة 1.5 مل. اترك الأنبوب المفتوح في درجة حرارة الغرفة في غطاء التدفق الصفحي لمدة 15 دقيقة تقريبا للسماح للإيثانول بالتبخر وتجفيف الصبغة الجهدية ، ثم أضف 997 ميكرولترا من وسط الثقافة الباردة عند أربع درجات مئوية إلى الأنبوب لإذابة الصبغة إلى تركيز نهائي يبلغ 12 ميكرومولار. بعد ذلك ، قم بإزالة وسط الثقافة من البئر.

أضف ملليلترا واحدا من محلول صبغة قياس الجهد إلى الخلايا. قم بتبريد الخلايا على أربع درجات مئوية واحتضانها لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الصبغة الجهدية واحتفظ به في أنبوب لإعادة استخدامه مرة أخرى لما يصل إلى ست تجارب متسلسلة في يوم واحد.

اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات بمحلول التيرود. بعد الغسيل الأخير ، ضع ماصة ملليلتر واحد من محلول التيرود منخفض البوتاسيوم في البئر. للبدء ، قم بإعداد خلايا HEK للتثقيب الكهربائي ، ثم قم بتكوين مزامنة توصيل النبض مع الحصول على الصورة باستخدام إشارة TTL من نظام المجهر الذي يقوم بتشغيل مولد النبض.

في الجزء السفلي من الغرفة ، ضع قطبين متوازيين من الأسلاك البلاتينية والإيريديوم بقطر 0.8 ملم ومسافة خمسة ملليمترات بين الحواف الداخلية. ثبت الغرفة تحت المجهر ، ثم قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمولد النبض. باستخدام جهد ومسبار حالي ، قم بتوصيل خرج مولد النبض براسم الذبذبات لتمكين التحقق من توصيل النبضة الصحيح أثناء التجربة.

ركز الخلايا على المجال الساطع وقم بتصوير الخلايا الموجودة في المنتصف بين الأقطاب الكهربائية. احصل على 80 صورة في وضع اللقطات المتتابعة بمعدل لا يقل عن 25 إطارا في الثانية. قم بإضاءة الخلايا بطول موجي للإثارة يبلغ 635 نانومتر ، واضبط وقت التعرض على 10 مللي ثانية ، واكتشف الانبعاث عند حوالي 700 نانومتر.

بعد الاستحواذ ، انتظر دقيقتين. اضبط الجهد على واجهة مولد النبض إلى 63 فولت. سجل فاصلا زمنيا بنفس الطريقة كل دقيقتين.

خلال عمليات الاستحواذ هذه ، قم بتطبيق نبضة واحدة مدتها 100 ميكروثانية في وقت الحصول على الصورة العاشرة. احصل على صور بجهد نبضي 63 و 75 و 88 و 100 و 125 و 150 و 175 و 200 فولت. تقدير المجال الكهربائي الذي تتعرض له الخلايا كنسبة الجهد إلى مسافة القطب المطبقة.

لتحليل البيانات ، قم بتصدير تسجيلات اللقطات المتتابعة إلى تنسيق TIFF ، ثم ضع جميع تسجيلات اللقطات المتتابعة للفولتية المطبقة من تجربة فردية في مجلد واحد. أعد تسمية كل تسجيل بفاصل زمني حتى يتمكن MATLAB من التعرف على المجال الكهربائي. بالنسبة للاستحواذ في بداية التجربة ، حيث لا يتم تطبيق نبض ، أعد تسميته باستخدام العبارة 000Vcm.

بعد ذلك ، افتح التطبيق الذي تم تنزيله من GitHub. انقر فوق تحديد مجلد البيانات"لاختيار المجلد الذي يحتوي على تسجيلات الفاصل الزمني لتجربة واحدة. لتحديد وحدات البكسل، استخدم منزلقي تمرير لتحديد العتبة المنخفضة للحصول على صورة واضحة للأغشية والعتبة العالية لإزالة الحطام من التحليل.

الآن ، انقر فوق تحليل البيانات. في علامة التبويب تحليل، سيظهر جدول يحتوي على معلمات مستخرجة. على الجانب الأيمن من الجدول ، سيتم عرض الرسوم البيانية للتألق النسبي بمرور الوقت لكل مجال كهربائي مستخدم.

حدد الرسوم البيانية لمجال كهربائي معين من القائمة المنسدلة على الجانب الأيسر أعلى الجدول. افحص جميع الرسوم البيانية وقم بإجراء التصحيح اليدوي في حالة اكتشاف الذروة الخاطئ. حدد مسح القمم التلقائية "في الجزء السفلي من علامة التبويب التحليل" لمسح القمم التي يتم اكتشافها تلقائيا.

انقر فوق الرسم البياني لتحديد نقطة ذروة جديدة يدويا. إذا لزم الأمر، حدد إعادة تشغيل الكشف التلقائي لذروة النتائج"في الجزء السفلي من علامة التبويب تحليل" لإجراء اكتشاف الذروة التلقائي مرة أخرى. سيتم الآن تعديل المعلمات المستخرجة إلى الذروة الجديدة.

بعد ذلك ، حدد تصدير البيانات "في أسفل يمين علامة التبويب تحليل" لتصدير البيانات إلى نفس المجلد مثل ملف dotmap وملف جدول بيانات وصور PNG لكل حقل كهربائي مستخدم. أدت النبضات الكهربائية البالغة 126 فولت لكل سنتيمتر إلى ظهور قمم مضان متعددة في الخلايا القابلة للإثارة ، كما يتضح من التذبذبات المميزة في تغير التألق بمرور الوقت. مع زيادة شدة المجال الكهربائي ، تغيرت الاستجابة وأظهرت إزالة استقطاب مستمرة عند 400 فولت لكل سنتيمتر.

لم تظهر الخلايا غير القابلة للإثارة أي قمم كبيرة استجابة لأدنى شدة المجال الكهربائي ، مما يشير إلى عدم وجود إثارة. في شدة المجال الكهربائي الأعلى ، أظهرت الخلايا غير القابلة للإثارة أيضا إزالة استقطاب مستمر ، مما يشير إلى التثقيب الكهربائي. لوحظ الحد الأقصى لعدد القمم في الخلايا القابلة للإثارة عند 150 فولت لكل سنتيمتر ، مع اتجاه تناقص في عدد القمم مع زيادة الجهد إلى ما بعد هذه النقطة.