التحكم الزماني المكاني لنشاط البروتين من خلال التنظيم الخيفي البصري الوراثي

يركز بحثنا الشامل على تطوير طرق بصرية وراثية تحقق تحكما دقيقا في الزمانية المكانية لنشاط البروتين عن طريق الضوء. نحن نصمم مجالات قابلة لإعادة تنظيم الضوء تسمى lightR للتنظيم الخيفي ، مما يسمح لنا بدراسة كيفية تأثير نشاط البروتين الذي يتم التحكم فيه مكانيا على الإشارات الخلوية والوظائف التي تساعد في نمذجة الأمراض قبل السريرية وتطوير العلاج. يواجه علم البصريات الوراثي العديد من التحديات بما في ذلك تحقيق تحكم دقيق وقابل للانعكاس في نشاط البروتين المستهدف ومحاكاة حركية الإشارات الداخلية بدقة.

تتمثل المشكلات الرئيسية في منع التنشيط غير المرغوب فيه ، وتمكين التنشيط المستهدف تحت الخلية ، وإدارة السمية الضوئية للحفاظ على بقاء الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تطوير أدوات قوية ومتوافقة عالميا أمرا بالغ الأهمية لتحسين تعدد الاستخدامات وقابلية التكرار في التطبيقات. يجمع بروتوكولنا لأدوات LightR الهندسية بشكل فريد بين العديد من الميزات المتقدمة في نظام واحد ، بما في ذلك التنظيم الخيفي ، والحساسية العالية ، والدقة المكانية ، والتحكم الزمني الصارم ، وخصوصية الإشارات الدقيقة.

يسمح هذا التكامل بقابلية الضبط عبر البروتينات المستهدفة المتنوعة ، ومعالجة الفجوات في الطرق الأخرى التي قد تفتقر إلى واحدة أو أكثر من هذه القدرات الحرجة. نحن مهتمون بتحديد الإشارات الرئيسية والعمليات الهيكلية التي تنظم هجرة الخلايا. نهدف إلى استخدام تقنيتنا البصرية الوراثية لتشريح لوائح هجرة الخلايا البطانية والتفاعلات.

افهم كيف يتم إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية بواسطة الخلايا البطانية ، وتحديد كيف يساهم خلل تنظيم هذه العمليات في تطور المرض. للتحليل الكيميائي الحيوي لصفيحة كينازات LightR واحدة في 10 إلى قوة ست خلايا لين XE لطبق ثقافة خلية 3.5 سم لكل مجموعة تجريبية ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 16 إلى 18 ساعة. في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا باستخدام بنية الحمض النووي المحددة باستخدام كاشف تعداء مناسب.

غطي الطبق بورق الألمنيوم وأعيديه إلى الحاضنة. بعد 16 إلى 18 ساعة من التعدي ، ضع نظام مصباح لوحة LED 465 نانومتر داخل حاضنة زراعة الأنسجة. ضع لوح زجاج شبكي مثقب على ارتفاع 10 سم فوق المصباح لتحقيق إضاءة بمقدار ثلاثة مللي واط لكل سنتيمتر مربع.

استخدم الإضاءة المستمرة في الخلايا التي تعبر عن LightR-Src و D388 R-LightR-Src. قم بتشغيل لوحة LED وإيقاف تشغيلها يدويا للتحكم في الإضاءة. في نهاية النقاط الزمنية التجريبية ، قم بحصاد الخلايا تحت الضوء الأحمر الآمن ، واستنشاق الوسائط وغسل الخلايا باستخدام PBS البارد.

تظهر الإضاءة العالمية لخلايا lin XE باستخدام LightR-Src المصمم هندسيا لمدة 60 دقيقة فسفرة ركائز Src ، وباكسيلين داخلي ، وخلايا p130Cas التي تعبر عن طفرة D388 RLightR-Src الحفازة غير النشطة لا تظهر أي فسفرة لركائز Src عند الإضاءة العالمية. للبدء ، صفيحة مرتين في 10 أس خمس خلايا هيلا لكل طبق زراعة أنسجة 35 ملم في وسط زراعة الخلايا. احتضان الخلايا لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بمجرد أن تلتصق الخلايا وتصل إلى 60 إلى 70٪ من التقاء ، قم بتوصيل خلايا هيلا بالمزيج المحدد. غطي الطبق بورق الألمنيوم لمنع الإضاءة العرضية للخلايا. ثم احتضان الخلايا لمدة 16 إلى 18 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد ذلك ، ضع أكواب مغطاة بقطر 25 ملم وسمك 0.17 ملم في غرفة من ستة ألواح آبار. قم بتغطية ثلاثة أغطية زجاجية مستديرة بخمسة ملليغرام لكل لتر من الفبرونيكتين في PBS واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. ثم اشطف زلات الغطاء باستخدام PBS بعد 16 إلى 18 ساعة من التعداد.

اجمع خلايا هيلا المنقولة في ضوء أحمر آمن ، ثم قم بتشغيل ما يقرب من مرة واحدة في 10 لقوة خمس خلايا هيلا منقولة على كل زلة غطاء تحت ضوء أحمر آمن. غطي اللوحة بورق الألمنيوم واحتضانها في وسط زراعة الخلايا لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بتسخين وسائط التصوير المحضرة والزيوت المعدنية إلى 37 درجة مئوية.

ثم اغسل زلات الغطاء التي تحتوي على الخلايا باستخدام PBS مرتين. بعد تلطيخ الخلايا وغسلها ، ضع زلة الغطاء بعناية في غرفة تصوير الخلايا الحية. أضف ملليلتر واحد من وسائط التصوير L15 إلى الغرفة.

أضف ملليلتر واحد من الزيت المعدني المسخن مسبقا إلى الوسائط لمنع التبخر أثناء التصوير. حافظ على حماية الغرفة من الضوء عند 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتصوير. ضع الغرفة على مرحلة مجهرية مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية.

حدد خلية واحدة تعبر عن كل من كرز LightR-Src السريع و Src و IRFP. حدد مناطق معينة ذات أهمية داخل الخلية لإضاءةها. في هذه الدراسة ، اختر مساحة صغيرة على محيط الخلية المحددة.

قم بتصوير الخلية المحددة كل دقيقة لمدة 20 دقيقة في الحالة القاعدية قبل الإضاءة. استمر في التصوير لمدة 50 دقيقة أثناء الإضاءة محليا متبوعا ب 20 دقيقة بعد التنشيط لمدة 90 دقيقة إجمالا. بعد التصوير ، احفظ الأفلام بتنسيق ملف tif stack للتحليل.

أدت الإضاءة العالمية لخلايا hela إلى توطين LightR-Src السريع إلى الالتصاقات البؤرية ، والتي تم عكسها بمجرد إيقاف الضوء الأزرق. تسببت هذه الإضاءة أيضا في زيادة كبيرة في انتشار الخلايا ، والتي توقفت بمجرد إطفاء الضوء الأزرق. لم يظهر طفرة D388 R-LightR-Src الحفازة غير النشطة أي انتشار للخلايا.

أدت الإضاءة الموضعية لخلايا hela التي تعبر عن LightR-Src السريع إلى تراكم البنية في التصاقات بؤرية ، مما أدى إلى نتوءات غشائية موضعية مع إضاءة لمدة 50 دقيقة. لم يلاحظ أي زيادة أخرى في الظلام لمدة 20 دقيقة بعد الإضاءة. اختفى Fast LightR-Src تدريجيا من الالتصاقات البؤرية في المرحلة المظلمة.

تحول المركزي للخلية نحو المنطقة المضيئة. بعد التنشيط السريع ل LightR-Src ، مما يشير إلى حركة الخلية الموجهة.