تصوير FRET أحادي الجزيء لمراقبة الديناميكيات التوافقية ل GTPase Atlastin الشبيه بالدينامين
يناير 24, 2025
تعتمد وظائف بروتينات عائلة الدينامين الفائقة على التغيرات التوافقية إلى جانب التحلل المائي GTP. يتم وصف النظام باستخدام تقنية FRET أحادية الجزيء (smFRET) لمراقبة الديناميكيات التوافقية ل GTPase atlastin الشبيه بالديناميات في حالات تحميل النيوكليوتيدات المختلفة.
نحن ملتزمون بدراسة آلية اندماج الأغشية داخل الخلايا. في هذا البروتوكول ، نهدف إلى إدراك الديناميكيات التوافقية لبروتين اندماج غشاء الشبكة الإندوبلازمية أتلاستين خلال دورة التحلل المائي GTP بواسطة smFRET. قد يوجد أتلاستين كمونومر أو ثنائي في دورة التحلل المائي GTP.
في تجارب الجزيء الواحد ، من الصعب العثور على استراتيجيات مناسبة لوضع العلامات على البروتين وتثبيت الحركة ، وفيما يلي يعرض الديناميكيات التوافقية للأتلاستين طوال دورة التحلل المائي GTP. بالمقارنة مع FRET السائبة ، يمكن ل smFRET مراقبة مطابقات البروتين بدقة في ظل حالات تحميل النيوكليوتيدات المختلفة ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة مباشرة لسلوك جزيئات المغير. استخدمنا smFRET لحل دورة التحلل المائي GTP للأتلاستين بشكل كامل خلال استراتيجيات الموضع المختلفة.
نعتقد أن النتائج التي توصلنا إليها ستعزز المزيد من الديناميكيات التوافقية في دراسة بروتينات التحلل المائي GTP ، وتوفر تفسيرات جديدة للعملية البيولوجية النادرة. لتنظيف سطح الغطاء ، استخدم الملقط لالتقاط ثمانية أغطية ، وضعها في وعاء تلطيخ. أضف 50 مل من الأسيتون لتغطية الغطاء ، وضع جرة التلوين في منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة.
شطف الأغطية ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج ، واغسلها بالميثانول في منظف بالموجات فوق الصوتية. بعد ذلك ، أضف محلول سمكة الضاري المفترسة إلى برطمان التلوين ، وقم بتسخينه في غلاية حمام مائي على حرارة 95 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد تبريد البرطمان إلى درجة حرارة الغرفة ، اشطف الغطاء ست مرات بالماء المقطر المزدوج.
أضف محلول ميثوكسيد الصوديوم في وعاء التلوين ، وضعه في منظف الموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة. بعد شطف الأغطية بالماء ، أضف الماء المقطر المزدوج إلى جرة التلوين ، وضعها في منظف الموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة. قم بتثبيت الأغطية في جرة التلوين وجففها بالنيتروجين.
انقل الأغطية المجففة إلى برطمان تلطيخ آخر ، واخبزي البرطمان في فرن تجفيف على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتبريد البرطمان إلى درجة حرارة الغرفة في مجفف. أضف 47.5 مل من الميثانول ، و 2.5 مل من حمض الأسيتيك ، و 0.5 مل من ثلاثي إيثوكسيسيلان إلى دورق واخلطه بالتساوي.
انقلي الخليط إلى برطمان التلوين واحتضنه لمدة 10 دقائق. اشطف الأغطية ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج في جرة التلوين ، وصوتنة لمدة خمس دقائق. بعد شطف الأغطية بالماء وتجفيفها بالنيتروجين كما هو موضح ، ضع الغطاءات في طبق بتري قطره 10 سم.
قم بإذابة SVA-mPEG و SVA-mPEG-Biotin في محلول عالي الملح بنسبة 1: 100. أسقط المزيج المحضر على غطاء وقم بتغطيته بغطاء آخر. احتضن الأغطية بالرطوبة المناسبة لمدة ساعتين أو طوال الليل.
بعد التعديل ، افصل الأغطية واشطفها بالماء منزوع الأيونات وجففها بالنيتروجين. ضع الغطاء المعدل بعناية في أنبوب سعة 50 مل. بعد تنقية مجال GTPase للبروتين الشبيه بالدينامين أتلاستين أو ATL المعبر عنه في خلايا الإشريكية القولونية Rosetta ، قم بتغيير المخزن المؤقت للبروتين إلى مخزن الإيثيوتينيل الحيوي للبروتين باستخدام مرشح طرد مركزي 10 كيلودالتون.
بالنسبة لبيوتينيل البروتين ، امزج 100 ميكرولتر لكل من 100 ملليمولار ATP ، و 100 مللي مولار أسيتات المغنيسيوم ، و 500 ميكرومولار D-biotin ، و 10 ميكرولتر من 100 ميكرومولار BirA biotin ligase ، و 50 ميكرومولار من البروتين إلى حجم نهائي قدره مليلتر واحد. احتضن الخليط طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة D-biotin الحر باستخدام مرشح طرد مركزي بوزن جزيئي 10 كيلودالتون.
احتضان 20 ميكرولترا من البروتين البيوتينيل مع 20 ميكرولترا من الستربتافيدين 15 ميكرومولار لمدة 20 دقيقة على الثلج. الكشف عن كفاءة بيوتينيل البروتين باستخدام SDS-PAGE. قم بإذابة الفلوروفورات LD555 و LD655 في ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى تركيز نهائي يبلغ خمسة مللي مولار.
لتحضير المخزن المؤقت لوضع العلامات ، اخلطي 25 ملليمولار HEPES و 150 مللي مولار كلوريد البوتاسيوم وخمسة مللي مولار كلوريد المغنيسيوم. قم بتغيير المخزن المؤقت للبروتين إلى المخزن المؤقت لوضع العلامات باستخدام مرشح طرد مركزي 10 كيلودالتون. بالنسبة لمقايسات smFRET داخل الجزيئات ، امزج ATL1cyto-TK مع LD555 و LD655 بنسبة 1: 1.2: 1.2 إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر.
يحتضن الخليط لمدة خمس ساعات عند أربع درجات مئوية. بالنسبة لمقايسات smFRET بين الجزيئات ، احتضان ATL1cyto-K مع LD555 و ATL1cyto-K الحيوي مع LD655 لمدة خمس ساعات عند أربع درجات مئوية. لتحضير غرفة تثبيت البروتين ، قم بلصق شريحة الغطاء المجهر المعدلة بعناية بشريط مخصص على الوجهين.
قم بتركيب الخراطيم والنصائح لتشكيل غرفة ميكروفلويديك بست قنوات. لتصحيحات رسم الخرائط ، أضف 10 ميكرولتر من جزيئات البوليسترين بنسبة 10٪ على شريحة مجهرية وقم بتغطيتها بغطاء غطاء. بعد ذلك ، تحت مجهر مضان الانعكاس الداخلي الكلي ، حدد مجال رؤية يحتوي على جزيئات البوليسترين والتقط مقطع فيديو في وضع المجال الساطع.
استخدم برنامجا نصيا مخصصا لمحاذاة الموقع المركزي لنفس جسيم البوليسترين في كل من القناتين المانحة والمتقبلة. احفظ ملف الخريطة كملف TXT. بالنسبة لتجارب smFRET بين الجزيئات ، امزج LD555 المسمى ATL1cyto-K مع LD655 المسمى ATL1cyto-K-biotin بنسبة واحد إلى واحد مع تركيز نهائي يبلغ مللي مولار واحد من GTP-gamma-S.
احتضن الخليط على الثلج لمدة ساعة لتضميع البروتينات. امزج LD555 المسمى ATL1cyto-T مع LD655 المسمى ATL1cyto-K-biotin بنسبة واحد إلى واحد مع مللي مولار واحد من GTP-gamma-S لتجارب ATL1cyto-T و ATL1cyto-K بين الجزيئات smFRET. احتضان الخليط على الثلج لمدة ساعة للحصول على بروتينات مختفوقة.
بعد ذلك ، بالنسبة لمقايسات smFRET داخل الجزيئات ، احتضن LD555 و LD655 المسمى ATL1cyto-TK مع مللي مولار واحد من الناتج المحلي الإجمالي على الجليد لمدة ساعة واحدة. بالنسبة للتجارب بين الجزيئات ، احتضن 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الستربتافيدين لمدة 10 دقائق لشل حركة البروتينات. بالنسبة للمقايسات داخل الجزيئات ، أضف 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الجسم المضاد المضاد للبيوتينيل واحتضانه لمدة 10 دقائق لشل حركة البروتينات.
بعد الحضانة ، أضف ثنائي ATL1 المخفف إلى البروتين الموجود في القناة واتركه يشل ثلولا لمدة 10 دقائق. اغسل القناة مرتين باستخدام مخزن مؤقت للحضانة. أضف حمض البنزويك و PCD إلى القناة بتركيز نهائي قدره 2.5 ملليمولار.
حدد الليزر 532 نانومتر كمصدر لضوء الإثارة. اضبط كاميرا EMCCD لتسجيل البيانات بفاصل إطارات يبلغ 30 مللي ثانية. احفظ الأفلام المسجلة بتنسيق TIFF 16 بت.
بعد الحصول على البيانات ، استخرج مسارات FRET من الأفلام المسجلة. حدد مسارات FRET واحفظها بتنسيق TXT. استخرج البيانات من ملفات TXT ، واحسب قيم FRET باستخدام البرامج النصية محلية الصنع في MATLAB.
قم بتركيب بيانات smFRET بواسطة GaussAmp في Origin للحصول على الرسم البياني للتوزيع.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في الديناميات المطابقية لبروتين انصهار غشاء الشبكة الإندوبلازمية atlastin أثناء دورة التحلل المائي لـ GTP باستخدام تقنية FRET أحادية الجزيء (smFRET). تسلط الدراسة الضوء على تحديات تسمية البروتين واستراتيجيات تثبيته في تجارب الجزيء الواحد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الفيزياء الحيوية
الخلفية
- بروتينات عائلة Dynamin مهمة لاندماج الغشاء.
- يمكن أن توجد Atlastin في أشكال أحادي أو ثنائي الجزيء أثناء التحلل المائي لـ GTP.
- توفر FRET أحادية الجزيء رؤى حول أشكال البروتين.
- فهم ديناميات atlastin ضروري لتوضيح آليات اندماج الغشاء.
هدف الدراسة
- استكشاف التغييرات المطابقية لـ atlastin أثناء التحلل المائي لـ GTP.
- استخدام smFRET لمراقبة ديناميات البروتين تحت حالات تحميل مختلفة للنوكليوتيدات.
- معالجة التحديات في تسمية البروتين وتثبيته في دراسات الجزيء الواحد.
الطرق المستخدمة
- تقنية FRET أحادية الجزيء (smFRET).
- استراتيجيات تجريبية لتسمية البروتين.
- تقنيات تثبيت لتجارب الجزيء الواحد.
- تحليل ديناميات دورة التحلل المائي لـ GTP.
النتائج الرئيسية
- يقوم smFRET بمراقبة فعالة لأشكال atlastin.
- تؤثر حالات تحميل مختلفة للنوكليوتيدات على ديناميات atlastin.
- تم معالجة التحديات في التسمية والتثبيت.
- حصلنا على رؤى حول دورة التحلل المائي لـ GTP لـ atlastin.
الاستنتاجات
- تعتبر smFRET أداة قوية لدراسة ديناميات البروتين.
- فهم التغييرات المطابقية لـ atlastin يساعد في استيعاب آليات اندماج الغشاء.
- يمكن للدراسات المستقبلية البناء على هذه النتائج لاستكشاف البروتينات الأخرى الشبيهة بالـ Dynamin.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Single-molecule FRET (smFRET) imaging of atlastin provides direct, quantitative insight into the conformational dynamics underlying GTPase-driven membrane fusion, a process relevant to neurodegenerative disease mechanisms. This approach enables high-resolution interrogation of mechanochemical protein function, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. The method's precision in monitoring nucleotide-dependent conformational states positions it as a reusable capability for biopharma discovery pipelines focused on membrane fusion and GTPase biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of conformational transitions in disease-relevant GTPases.
- Supports mechanistic de-risking by linking nucleotide state to structural dynamics.
- Facilitates functional target validation through real-time single-molecule analysis.
- Improves predictive confidence for portfolio triage of membrane fusion targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated single-molecule assays for quantitative conformational readouts.
- Enables reproducible measurement of protein dynamics under defined nucleotide states.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators or inhibitors.
- Provides a platform for scalable, high-content mechanistic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns conformational biomarkers with disease-relevant mechanistic endpoints.
- Ensures continuity from molecular discovery to preclinical validation of GTPase function.
- De-risks advancement decisions by providing quantitative mechanistic evidence.
- Supports translational research into rare neurodegenerative disorders linked to atlastin dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
smFRET imaging of atlastin integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and translational research, enabling iterative hypothesis testing and functional validation.
- Discovery Biology: Provides quantitative evidence for conformational changes during GTP hydrolysis, clarifying mechanistic pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative FRET outputs for comparative analysis of nucleotide states and modulators.
- Analytics: Generates high-content single-molecule data for statistical comparison of protein conformations.
- Translational Research: Links molecular dynamics to disease-relevant phenotypes in neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform for studying other mechanochemical proteins beyond atlastin.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-molecule assay workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of membrane fusion and GTPase-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence and protein biochemistry.
- Demands specialized instrumentation such as TIRF microscopy and EMCCD cameras.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of labeling and immobilization protocols.
- Adaptation to other mechanochemical proteins may require optimization of labeling strategies.
- Throughput and data analysis depend on robust computational infrastructure and custom scripts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:22
Preparation and Modification of Coverslips for Protein Immobilization in Chambers
4:12
Protein Biotinylation and Fluorophore Labeling for Single-Molecule Frster Resonance Energy Transfer (smFRET) Assays
6:41
Single-Molecule FRET Imaging and Data Analysis for GTP Hydrolysis Cycle of Atlastin
