تصور مصائد العدلات خارج الخلية في الأوردة المساريقية بعد إصابة نقص التروية المساريقية وإعادة التروية عبر الفحص المجهري داخل الحيوية

دور جينات معينة في بداية وتطور تجلط الدم ، في هذه الحالة ، نحقق في تعبير PAR1 البطاني على إصابة نقص التروية وإعادة الضهار. نحاول تحديد تأثير البطانة على الاستجابة ، سواء بعد نقص التروية أو أثناء إعادة التروية. أحد الجوانب المهمة حقا التي لم تتم دراستها حتى الآن هو تحديد دور التوافق في الأمعاء في إصابة نقص تروية المساريق.

لدراسة هذا السؤال ، جمعت مجموعتنا بين الفحص المجهري داخل الحيوية ونموذج إصابة نقص تروية المساريق ، وقمنا بدمج ذلك مع نماذج الفئران الخالية من الجراثيم. تطبيق نماذج تجلط الدم على الفئران المعدلة وراثيا بالاشتراك مع الفحص المجهري داخل الحيوية ، تتيح هذه التقنيات المراقبة في الجسم الحي للسلوكيات الخلوية أثناء ظهور المرض. يمثل إجراء النماذج التجريبية على الكائنات الحية تحديا دائما ، حيث تتأثر التجربة بالعديد من العوامل بما في ذلك الجنس والعمر وعلاج التخدير وتغييرات لوائح رعاية وما إلى ذلك.

أيضا ، بدأ البحث في تجلط الدم في القرن الماضي. ولا تزال العديد من العوامل المساهمة في ذلك دون حل. تدرس مجموعتي دور ميكروبات الأمعاء في تجلط الدم وتصلب الشرايين ووظيفة الصفائح الدموية والأوعية الدموية.

للبدء ، ضع الفأر المخدر والحليق في الاستلقاء الظهري على وسادة التدفئة. قم بتوصيل الماوس بنظام الأكسجين عبر مخروط الأنف. قم بتثبيت أطراف الماوس بالوسادة الساخنة بشريط جراحي.

لزرع القسطرة في الوريد الوداجي ، قم بعمل شق عرضي فوق القصبة الهوائية. قم بإزالة الجلد الذي يغطي الرقبة وعزل الوريد الوداجي الأيمن. ثم ، باستخدام خيط حريري يبلغ طوله خمسة سنتيمترات ، أغلق الطرف البعيد للوريد وثبته بالملقط الجراحي.

ضع ثلاثة خيوط حريرية على بعد سنتيمترين تقريبا أسفل الوريد ، أحدهما بالقرب من الطرف البعيد ، واثنان بالقرب من الطرف القريب من الوريد الوداجي. اربط عقدة جراحية ، لكن لا تغلق الوعاء. املأ قسطرة البولي إيثيلين بكلوريد الصوديوم 0.9٪.

قم بإزالة فقاعات الهواء وقم بتوصيلها بحقنة سعة مليلتر واحد. استخدم المقص لقطع ثقب بين العقدتين الثانية والثالثة وزرع القسطرة في الوريد الوداجي. شفط المحقنة للتأكد من وجود الدم في القسطرة.

اربط خيط الحرير لتثبيت القسطرة في الوريد. ثم استخدم شريطا طبيا لتأمين المحقنة. املأ محاقن مليلتر واحدة ببرتقال أكريدين بتركيز نهائي 0.5 ملليغرام لكل مليلتر وصبغة الحمض النووي بتركيز خمسة ميكرومولار.

حقن 50 ميكرولترا من SYTOX Orange لمصائد العدلات خارج الخلية ، أو NETs. قم بتطهير جلد بطن الفأر بجولات متناوبة من الدعك والكحول الذي يحتوي على اليود. ثم ، باستخدام مشرط ، قم بإجراء بضع البطن من ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات على طول ألبا الخطي.

ضع الأمعاء برفق خارج تجويف البطن باستخدام طرفين قطنيين مبللين بالمحلول الملحي وحدد موقعا بأقل قدر من التغطية بالدهون. ضع أغصان صغيرة من الأمعاء على عجينة سوداء لتقليل إشارة الخلفية. حقن 50 ميكرولترا من البرتقال الأكريدين من خلال قسطرة الوريد الوداجي لتصور الكريات البيض الملطخة.

احصل على فيديو الأمعاء قبل إعادة تروية نقص التروية. تحضير كمادات مبللة بكلوريد الصوديوم ووضع الأمعاء فيه. انسداد الشريان المساريقي العلوي بمشبك وعائي صغير.

ادفع الأمعاء برفق إلى تجويف البطن باستخدام مسحات قطنية مبللة بالمحلول الملحي. استخدم خياطة 7-0 لإغلاق جدار البطن ومنع فقدان الرطوبة ودرجة الحرارة. بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة الخياطة.

بعد الفترة الإقفارية ، ضع بضع قطرات من المحلول الملحي على المنطقة المقطوعة. بعد ذلك ، قم بإزالة مقاطع الأوعية الدموية الدقيقة برفق باستخدام مشبك. باستخدام أطراف قطنية مبللة بالمحلول الملحي ، ضع الأمعاء برفق مرة أخرى خارج تجويف البطن وضع الفروع الصغيرة للوريد على عجينة سوداء.

حقن 50 ميكرولترا من البرتقال الأكريدين والتقط فيديو ما بعد الإقفار للوريد. قم بتشغيل المجهر الفلوري عالي السرعة وواسع المجال المزود بمكثف لمسافات طويلة وأحادي اللون وهدف غمر الماء 10 مرات وكاميرا جهاز مقترنة بالشحن. اضبط وقت التعرض على 30 مللي ثانية وحدد قناة 5B مع مرشحات Alexa Fluor 488 و Rhodamine Red المثبتة لتصور الكريات البيض و NETs.

تحديد التوظيف الكمي للخلايا ضمن منطقة فائدة تبلغ مساحتها 0.06 مليمتر مربع. بعد ذلك ، قم بتحديد كمية الكريات البيض الملتصقة عن طريق عد الخلايا التي ظلت ثابتة أو متصلة بالبطانة خلال فترة مراقبة مدتها 20 ثانية. تحديد NETs المصنفة بكل من أصباغ الفلورسنت للكريات البيض والحمض النووي.

زاد التصاق الكريات البيض بالبطانة المساريقية الإقفارية في كل من مجموعات دلتا EC من النوع البري و F2r بعد إصابة نقص التروية وإعادة التروية ، مع ملاحظة التصاق أقل بشكل ملحوظ في مجموعة F2r delta EC ، مما يعني دور PAR1 البطاني في تجنيد الكريات البيض. بعد إصابة نقص التروية وإعادة التروية ، لوحظت NETs فقط في المجموعة البرية التي تعبر عن المستويات الطبيعية من PAR1 على الخلايا البطانية ، مما يشير إلى الدور التنظيمي ل PAR1 في NETosis.