Name: استئصال بانيات العظم بوساطة ليزر ثنائي الفوتون في يرقات الزرد النامية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: تعلم تقنية استئصال الليزر ثنائي الفوتون لدراسة تجديد العظام في يرقات الزرد. يُظهر هذا البروتوكول دور الاستجابة المناعية في استعادة العظم وآليات الشفاء.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

حصل بروتوكول الدراسة على موافقة من Landesdirektion Sachsen ، أرقام التصاريح 25-5131 / 564/2 ، DD25-5131 / 450/4 ، 25-5131 / 496/56 ، DD25.1-5131 / 354/87. تم الحفاظ على سلالات أسماك الزرد المستخدمة وفقا للقانون الوطني وفي ظل ظروف موحدة كما هو موضحسابقا 27،28. تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد.
1. تحضير المواد والحلول
<ol><li>حافظ على الأجنة في وسائط 1x E3. قم بإعداد وسائط 1x E3 عن طريق تخفيف 170 مل من مخزون 60x E3 في 10 لتر من الماء منزوع الأيونات وإضافة 2 مل 0.1٪ ميثيلين بلو.<ol><li>قم بإعداد مخزون وسائط 60x E3 عن طريق خلط 17.2 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.76 جم من KCl ، 2.90 جم من CaCl2 · 2 H2O ، 4.90 جم من MgSO4·7 H2O في 1 لتر من الماء المعقمة منزوع الأيونات.</li>
	</ol></li>
	<li>لتضمين اليرقات ، قم بإعداد حصولات من 1٪ من الاغاروز ذات نقطة الانصهار المنخفضة (LMA) مسبقا واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة.<ol><li>لتحضير الحصص ، قم بإذابة LMA في وسائط 1x E3 ، على سبيل المثال ، 500 مجم من LMA في 50 مل من 1x E3 في قارورة Erlenmeyer ، وقم بتسخين المحلول في الميكروويف حتى يذوب الاغاروز تماما ، وقم بتوزيعه على 1 مل في أنابيب سعة 1.5 مل.</li>
	</ol></li>
</ol>2. تربية أسماك الزرد وجمع الأجنة
ملاحظة: تم استخدام يرقات الزرد المعدلة وراثيا المزدوجة التي تبلغ عن وجود بانيات العظم الملتزمة [osterix: nGFP = Tg (Ola.Sp7: NLS-GFP) zf132] 29 والضامة [mpeg: mCherry = Tg (mpeg: mCherry) gl23] هنا30 (الشكل 1 أ).
<ol><li>قم بإعداد سمك الزرد الأبوي مع الجينات المعدلة وراثيا الفردية المرغوبة في أقفاص التزاوج القياسية في المساء السابق للتزاوج. ملاحظة: تسمح أقفاص التزاوج القياسية للبيض بالمرور إلى حجرة سفلية حيث لا تستطيع أسماك الزرد الأبوية الوصول إليها.<ol><li>حافظ على فصل الذكور والإناث حتى التزاوج باستخدام مقسم في قفص التزاوج. قم بإزالة الحاجز في صباح اليوم التالي لبدء التزاوج.</li>
	</ol></li>
	<li>في الظهيرة ، على أبعد تقدير ، قم بإزالة سمك الزرد الأبوي من أحواض التكاثر وجمع الأجنة ، مما يؤدي إلى إجهاد الماء من قفص التزاوج من خلال غربال. ملاحظة: في حالة أن العمر الدقيق لليرقات حاسم ، قم بحصاد الأجنة على فترات منتظمة تبلغ حوالي 30 دقيقة. يجب استخدام رفقاء القابض في التجارب مع مجموعات تجريبية مختلفة.</li>
	<li>ضع الأجنة في طبق قطره 100 مم يحتوي على 1x E3 واحتفظ بها في حاضنة عند 28 درجة مئوية31.</li>
	<li>قم بإزالة البويضات غير المخصبة والأجنة الميتة من الطبق باستخدام ماصة بلاستيكية بمساعدة مجهر مجسم وقم بتغيير وسائط 1x E3 يوميا.</li>
	<li>قبل التجربة ، قم بفرز اليرقات الإيجابية للجينات المعدلة وراثيا للمراسل باستخدام مجهر مجسم فلوري.</li>
</ol>3. تضمين اليرقات في الاغاروز منخفض الذوبان
<ol><li>قم بإذابة كميات LMA في كتلة حرارية أو حمام مائي عند 65 درجة مئوية. بمجرد ذوبان LMA ، احتفظ به عند 42 درجة مئوية حتى التضمين (الشكل 1 ب). أضف 50 ميكرولتر من 0.4٪ MS-222 إلى 1 مل من LMA المذاب لتحقيق تركيز 0.02٪ MS-222 للتخدير.</li>
	<li>تخدير 4 dpf (أيام بعد الإخصاب) يرقات (أو يرقات أقدم) في وسائط 0.02٪ MS-222 E3.</li>
	<li>انقل اليرقات المخدرة إلى طبق ميكرو بئر زجاجي القاع باستخدام ماصة باستور بلاستيكية سعة 3 مل وقم بإزالة وسائط E3 الزائدة بنفس الماصة (الشكل 1 ب). تجنب جفاف اليرقات. ملاحظة: يمكن تضمين أكثر من يرقة واحدة في طبق في وقت واحد. يوصى بتضمين 3 إلى 5 يرقات لإتاحة الوقت الكافي لوضعها.</li>
	<li>خذ أغروز LMA المذاب من الحمام المائي / الكتلة الحرارية وأضف قطرة (تبريد) من LMA إلى الطبق ، وتغطي القاع الزجاجي حيث تم وضع اليرقات. انتبه إلى أن LMA ليس ساخنا جدا ولكنه لا يزال سائلا.</li>
	<li>ثم ضع اليرقات في الوضع الجانبي المطلوب قبل أن يتجمد الاغاروز. هنا ، تأكد من وضع جانبي يكون فيه الأوبيركل أقرب ما يمكن إلى القاع الزجاجي للطبق كتحضير لإعداد المجهر العكسي (الشكل 1 ب).</li>
	<li>دع الاغاروز يتجمد ثم أضف وسائط E3 (تحتوي على 0.02٪ MS-222 كحد أقصى) إلى الطبق لتجنب تجفيف الاغاروز (الشكل 1 ب).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig01.jpg"> الشكل 1: التمثيل التخطيطي لإجراء التضمين. (أ) Tg المزدوج المعدلة وراثيا (osterix: nGFP; mpeg1: mCherry) تم استخدام 29،30 يرقات من سمك الزرد مع بانيات عظمية تشغيلية ذات علامة خضراء وضامة تحمل علامة حمراء. (ب) سير عمل إجراء التضمين، على النحو المبين في الخطوة 3 من البروتوكول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
4. التصوير في الجسم الحي لليرقات والاستئصال بالليزر
<ol><li>لاستئصال بانيات العظم بالليزر في الأوبركل النامي لأسماك الزرد المعدلة وراثيا Tg (osterix: nGFP; mpeg1: mCherry) 29،30 ، استخدم مجهر مسح ليزر مقلوب ثنائي الفوتون مع هدف مائي 25x / 0.95 أو إعداد مكافئ.</li>
	<li>ضع الطبق مع اليرقات المضمنة على المرحلة المجهرية عند المجهر المقلوب وضع المنطقة المطلوبة للاستئصال في وسط مجال الرؤية. يمكن التعرف على الوظيفة بسهولة بمساعدة إشارة مضان GFP.</li>
	<li>بمجرد تركيز الوظيفة وتوسيطها في مجال رؤية المجهر ، اختر إعدادات z-stack (غالبا ما يتم استخدام فواصل زمنية z-1-2 ميكرومتر) لتصوير اتساع الوظيفة بالكامل. في الوقت نفسه ، اختر المنطقة في مستوى z معين ليتم استئصاله (عادة في المنطقة الخلفية من الأوبركل). يتم ممارسة الاستئصال بالليزر ثنائي الفوتون فقط في هذا المستوى. ملاحظة: ستؤدي الدقة الأعلى في البعد z إلى أوقات تصوير أطول ولكنها ستمكن من إجراء تحليلات حجمية للبيانات المكتسبة لاحقا.</li>
	<li>قم بتصوير منطقة الاهتمام قبل الاستئصال. للكشف عن GFP ، استخدم ليزر الضوء الأبيض عند 488 نانومتر وكاشف هجين يتراوح من 495 نانومتر إلى 550 نانومتر أو ما يعادله. قم بتصوير البلاعم باستخدام إثارة 555 نانومتر (ليزر الضوء الأبيض) ، مع نطاق اكتشاف mCherry من 595 إلى 780 نانومتر على كاشف هجين (أو ما يعادله).<ol><li>استخدم تنسيق الصورة 512 × 512 للحصول على نسبة جودة / وقت جيدة (يمكن استخدام تنسيقات أخرى إذا كانت الدقة الأعلى أو السرعة الأعلى مطلوبة). ملاحظة: يمكن استخدام حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها مثبتة في المجهر وتعديلها ، على سبيل المثال ، إلى 28 درجة مئوية.</li>
	</ol></li>
	<li>ارسم منطقة دائرية بقطر 25 ميكرومتر (يمكن تحديد الأشكال والأحجام الأخرى حسب التجربة) في مستوى ثنائي الأبعاد محدد ، مع التركيز على الأوبركل باستخدام أداة عائد الاستثمار.</li>
	<li>لإجراء الاستئصال ، قم بتطبيق طاقة الاستئصال (تقاس بدون هدف) عند 450 ميجاوات وقم بتعريض المنطقة المحددة لليزر ثنائي الفوتون بسرعة مسح 400 هرتز ومدة إجمالية تبلغ 10 ثوان. أثناء الاستئصال ، يمكن تصور المنطقة باستخدام كاشف هجين في حدود 401-443 نانومتر أو ما يعادله.</li>
	<li>بعد الاستئصال ، قم بتأكيد الاستئصال هيكليا عن طريق تصوير نفس z-stack مرة أخرى بنفس الإعدادات المستخدمة قبل الاستئصال. لم تعد المنطقة المستعصية تحتوي على خلايا فلورية.</li>
</ol>5. استعادة اليرقات والتصوير لمراقبة تجنيد الخلايا المناعية
<ol><li>إذا كان من الضروري إجراء تصوير تجنيد الخلايا المناعية مع تأخير ، فاسترجع اليرقات من التصوير والتخدير. قم بإزالة اليرقات بعناية من LMA باستخدام ملقط أو إبرة تشريح.<ol><li>أولا ، قم بإزالة طبقة من الاغاروز تغطي اليرقات. ثانيا ، قم بإزالة الاغاروز على اتصال مباشر مع اليرقات. احذف هذه الخطوة إذا كان التصوير الفوري لتجنيد الخلايا المناعية قيد البحث.</li>
	</ol></li>
	<li>ضع اليرقات مرة أخرى في طبق به وسائط E3 نقية وتحقق من استعادتها. يتضح الانتعاش من خلال سباحة اليرقات.</li>
	<li>عند 4 أو 6 سنوات من الآفة (ساعات بعد الآفة) ، قم بتصوير منطقة الأوبركل مرة أخرى باستخدام نفس الإعدادات في نفس المجهر للتحقق من آثار الاستئصال على تجنيد البلاعم. للقيام بذلك، كرر التضمين (الخطوة 3) والتصوير كما تم إجراؤه من قبل (الخطوة 4).</li>
	<li>بعد التصوير ، قم بإزالة اليرقات من LMA. يمكن إجراء التضحية باليرقات إما عن طريق الحضانة في الماء المثلج أو بجرعة زائدة من MS-222 في E3 ، اعتمادا على المتطلبات القانونية. يمكن بعد ذلك استخدام العينات لدراسات المتابعة أو التخلص منها.</li>
</ol>6. تحليل الصور والتحليل الإحصائي
<ol><li>قم بمعالجة الصور باستخدام برنامج معالجة الصور مثل Fiji32. اعتمادا على دقة z للبيانات المكتسبة ، يمكن إجراء التحليلات في 2D أو 3D.</li>
	<li>قم بتحديد كمية البلاعم يدويا إما عن طريق تضمين الخلايا المنفصلة بوضوح ، مثل تمييز أجسام الخلايا الرئيسية ، أو بدلا من ذلك تحديد الخلايا بملصق نووي أو عن طريق قياس المنطقة في حالة تداخل الخلايا (الخطوة التالية).</li>
	<li>لقياس المنطقة ، قم بإنشاء قناع يشمل البلاعم. للقيام بذلك ، استخدم أداة Image &gt; ضبط &gt; Threshold وقم بإنشاء عائد استثمار (تحليل أدوات &gt; &gt; مدير ROI &gt; إضافة) في فيجي. استبعاد الجسيمات الصغيرة في الخلفية للقياس الكمي.<ol><li>ثم قم بقياس المنطقة (تحليل &gt; القياس). ضع في اعتبارك ما إذا كانت مناطق التألق الخلوي المتداخل بحاجة إلى تضمينها في القياس. ملاحظة: هنا ، تم حذف منطقة الاستئصال الدائري من قياسات المنطقة حيث لا يمكن تمييز البلاعم المجندة في هذا المجال.</li>
	</ol></li>
	<li>إنشاء رسوم بيانية ترسم نتائج القياس باستخدام برنامج مناسب. لمقارنة البيانات قبل وبعد الاستئصال ، قم بإجراء اختبار إحصائي مناسب (هنا ، تم إجراء اختبار t أحادي الذيل المزدوج). ملاحظة: يمكن إعداد الأشكال باستخدام برامج تحرير الصور والتصميم الجرافيكي.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>طريقة الاستئصال بالليزر لدراسة تجديد العظام في يرقات الزرد

<ol><li>Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+regeneration%3A+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Model systems for regeneration: Zebrafish.</a> Dev. 146 (18), dev167692(2019).</li>
<li>Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+biology+and+disease+modeling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal biology and disease modeling in zebrafish.</a> J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).</li>
<li>Geurtzen, K., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+injury+models+to+study+the+effects+of+prednisolone+in+regenerating+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue.</a> J Vis Exp. (140), e58429(2018).</li>
<li>Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+zebrafish+bone+crush+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">A new zebrafish bone crush injury model.</a> Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).</li>
<li>González-Rosa, J. M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoinjury+as+a+myocardial+infarction+model+for+the+study+of+cardiac+regeneration+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish.</a> Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).</li>
<li>Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+fin+regeneration+after+cryoinjury-induced+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage.</a> Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).</li>
<li>Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+amputated+zebrafish+fin+rays+from+de+novo+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts.</a> Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast+production+by+reserved+progenitor+cells+in+zebrafish+bone+regeneration+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance.</a> Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).</li>
<li>Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+osteoblast+ablation+triggers+a+pro-osteogenic+inflammatory+response+regulated+by+reactive+oxygen+species+and+glucocorticoid+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish.</a> Dev. 149 (8), 1998030(2022).</li>
<li>Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscope-based+laser+ablation+and+regeneration+assay+in+zebrafish+interneuromast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells.</a> J Vis Exp. (159), e60966(2020).</li>
<li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> J Vis Exp. (54), e2845(2011).</li>
<li>Goldstein, A. M., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord+regulates+cardiac+lineage+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).</li>
<li>Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+sonic+hedgehog-a-expressing+cells+during+fin+regeneration+affects+ray+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).</li>
<li>Marshall, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+cell+and+tissue+level+laser+ablation+methods+to+study+morphogenetic+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics.</a> Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).</li>
<li>Angelo, J. R., Tremblay, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+cell+ablation+during+post-implantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development.</a> Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+pancreatic+cancer+using+a+cylindrical+light+diffuser%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser.</a> Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).</li>
<li>Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+for+cerebral+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Clin+N+Am%22%5BJournal%5D)">Laser ablation for cerebral metastases.</a> Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).</li>
<li>Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+laser+ablation+to+measure+cell+and+tissue-generated+forces+in+the+zebrafish+embryo+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo.</a> Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).</li>
<li>Vogel, A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pulsed+laser+ablation+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues.</a> Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).</li>
<li>Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-based+tumor+ablation%3A+Role+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-based tumor ablation: Role of the immune response.</a> Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).</li>
<li>Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Identification+of+dying+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Identification of dying cells.</a> Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).</li>
<li>Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+tissue+regeneration+by+modulating+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Promoting tissue regeneration by modulating the immune system.</a> Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).</li>
<li>Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+modulate+adult+zebrafish+tail+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration.</a> Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).</li>
<li>Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+suppressive+and+bone+inhibitory+effects+of+prednisolone+in+growing+and+regenerating+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues.</a> J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).</li>
<li>Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+in+the+regenerating+fin+reflect+tissue+homeostasis+disturbances+in+zebrafish+by+affecting+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol.+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling.</a> Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Breeding+and+Embryo+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+II%3A+Mouse%2C+Zebrafish%2C+and+Chick%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Breeding and Embryo Handling.</a> Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+combines+with+planar+polarised+patterning+during+metaphase+to+orient+embryonic+epithelial+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions.</a> Dev. 151 (10), dev202862(2024).</li>
<li>Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+complexity+of+cell+death%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Diversity and complexity of cell death: A historical review.</a> Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).</li>
<li>O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zones+of+cellular+damage+around+pulsed-laser+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds.</a> PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).</li>
<li>Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+clearance+of+damaged+tissue+following+laser+ablation+in+engineered+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues.</a> APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).</li>
<li>Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم, CaCl2& middot; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>طبق ثقافة الخلية ، PS ، 100/20 مم</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 55 Foceps</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td>شكل طرف مستقيم ، 11 سم ، 0.05 × 0.02 مم</td></tr><tr><td>Falcon 6-well لوحة</td><td>Corning</td><td>353502</td><td></td></tr><tr><td>طبق ميكروويل زجاجي</td><td>قاع MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>طبق 35 مم ، رقم 1.5 غطاء ، قطر زجاج 14 مم ، ليزر غير مصقول</td></tr><tr><td>Insight X3</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite</td><td>LAS X ، Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low ذوبان agarose &nbsp ؛</td><td>Biozyme</td><td>840101</td><td>Biozym Plaque Agarose</td></tr><tr><td>كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات ، MgSO4 & middot ؛ 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>أقفاص</td><td></td><td></td> التزاوج <td>العديد من الأصناف ، على سبيل المثال Tecniplast</td></tr><tr><td>Methyleneblue</td><td>Carl Roth</td><td>A514.1</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم ، KCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131494 كلوريد</td><td></td></tr><tr><td>الصوديوم ، كلوريد الصوديوم كارل</td><td>روث</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>SP8 FALCON&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>مجهزة بليزر Insight X3 متعدد الفوتون وبرنامج Leica Application Suite</td></tr><tr><td>إبرة تشريح الفولاذ المقاوم</td> للصدأ <td>Bochem</td><td>12010</td> نظام مجهر ستيريو <td>140 مم</td></tr><tr><td>SZX16</td><td>Olympus</td><td></td><td>مجهزة بقاعدة إضاءة LED خزانات ثرموستاتي SZX2-ILLTQ</td></tr><tr><td>TS - WTW</td><td>xylem</td><td>TS 608 / 2-i</td><td>للحضانة (الجنين)</td></tr> النقل <tr><td> ماصة ، 3.5 مل</td><td>861171 SARSTEDT</td><td></td><td>155 × 15 مم ، LD-PE ، Zeiss</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V12 الشفاف الإصدار 4.7.1.0.</td><td>زايس</td><td></td><td>مجهزة بكاميرا Axiocam MRm وبرامج AxioVision</td></tr></tbody></table>

استئصال بانيات العظم بوساطة ليزر ثنائي الفوتون في يرقات الزرد النامية

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

تم إجراء الاستئصال بالليزر كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. اختفت إشارة GFP لبانيات العظم في المنطقة المستعصية على الفور بعد الاستئصال. لدراسة استجابة استئصال بانيات العظم من حيث الاستجابة المناعية ، تم تصوير وجود الضامة في يرقات 6 dpf قبل وعند 6 hpl. قبل الاستئصال ، لوحظ عدد قليل جدا من البلاعم في منطقة الأوبركل10 (الشكل 2). عند 6 درجات الحرارة ، تم الكشف عن تراكم قوي للبلاعم في منطقة البراعم المفصولة وزيادة عدد البلاعم في مجال الرؤية ، بما في ذلك البراكل والمنطقة المحيطة بالأوبركل، 10 (الشكل 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig02v2.jpg"> الشكل 2: تجنيد البلاعم عند 6 هشلون في يرقات 6 dpf من يرقات أسماك الزرد. منطقة Opercle بدون استئصال وعند 6 hpl. يتم تمييز بانيات العظم الجراحية باللون الأخضر ، والضامة باللون الأرجواني ، وتشير الدائرة المتقطعة إلى المنطقة المستعصية بالليزر. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تم تحليل تجنيد البلاعم أيضا في 4 يرقات dpf مع عمليات أصغر بكثير عند 4 hpl لملاحظة نتائج مماثلة (الشكل 3). أظهر القياس الكمي لعدد البلاعم (خارج موقع الاستئصال الفوري بالليزر) زيادة في الإطار الزمني الذي تم فحصه (4.00 ± 2.37 ضامة قبل الاستئصال مقابل 7.00 ± 2.76 ضامة عند 4 هكتار) (الشكل 3 ب)). وبالمثل ، زادت مساحة البلاعم (المقاسة بميكرومتر2 ، 785.8 ميكرومتر2 ± 723.1 ميكرومتر2 قبل الاستئصال مقابل 1553 ميكرومتر2 ± 869.9 ميكرومتر2 عند 4 هكتار) (الشكل 3 ج). نظرا لأنه يصعب أحيانا التمييز بين البلاعم ، يوصى بقياس مساحة البلاعم بدلا من رقم البلاعم ، كما حدث هنا.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig03.jpg"> الشكل 3: تجنيد البلاعم عند 4 هشلون في 4 يرقات أسماك الزرد dpf. (أ) منطقة الجراحة بدون استئصال وعند 4 درجات حرارة. يتم تمييز بانيات العظم الجراحية باللون الأخضر ، والضامة باللون الأرجواني ، وتشير الدائرة المتقطعة إلى المنطقة المستعصية بالليزر. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي لعدد الضامة في منطقة البراكل مباشرة قبل (0 hpl) وبعد الاستئصال (4 hpl). (ج) القياس الكمي لمنطقة البلاعم (باستثناء موقع الاستئصال بالليزر). اختبارات t ذات الذيل الواحد. تمثل كل نقطة بيانات يرقة واحدة ، ويظهر متوسط ± SD ، ن = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

two-photon-laser-mediated-ablation-osteoblasts-developing-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

نحن هنا تصف طريقة لتركيب الأجنة الزرد لفترة طويلة الأجل والتصوير ، واثنين من الفوتون التصوير وتقنيات الأنسجة الضرر ، والوقت الفاصل بين التصوير مبائر.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

إصابة الكلى الحاد (كونا) في البشر مشكلة شائعة السريرية الناجمة عن الأضرار التي لحقت الخلايا الظهارية التي تشكل النيفرون الكلى ، ويرتبط آكي مع ارتفاع معدلات الوفيات من 50-70...

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

الأسلوب المعروضة هنا تشمل إصابة الأجنة الزرد دقيقة حية مع نبضات الليزر عالية الطاقة وتحليل لاحقة من هذه الإصابات والشفاء مع مرور الوقت. نعرض أيضا كيف وصفت واحدة أو وراثيا يمكن تتبع مجموعات من خلايا عضلات الهيكل العظمي أثناء وبعد ضوء الليزر التي يسببها الضرر.

الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

يصف هذا الفيديو طريقة إصابة المحاور في أجنة أسماك الزرد باستخدام بضع المحوريات بالليزر الفوتون ومراقبة الشفاء المحوري من الإصابة.

بضع الأكسونات بالليزر ثنائي الفوتون: طريقة لإصابة المحاور في أجنة أسماك الزرد ومراقبة الانتعاش المحوري

Source: Morsch, M.,  وآخرون. ، Trigger cell stress and death using conventional uv laser confocal المجهري. J. Vis. Exp. (2017)...

الاستئصال الانتقائي بالليزر أحادي الخلايا العصبية في يرقة الزرد باستخدام مجهر متحد البؤر

المصدر: موتو، أ.،  وآخرون. استئصال مجموعة عصبية باستخدام ليزر ثنائي الفوتون وتقييمه باستخدام تصوير الكالسيوم والتسجيل السلوكي في يرقات الزرد. J. Vis. Exp. (2018)  في هذا الفيديو،  تم عرض إجراء الاستئصال بالليزر ثنائي الفوتون ، مما يتيح التدمير الانتقائي للخلايا العصبية الفلورية في يرقات الزرد المجمدة بالأغاروز. يؤكد التصوير عالي الدقة قبل الإجراء وبعده تلف الخلايا العصبية الفعال ، كما لوحظ من خلال غياب التألق.

الاستئصال العصبي المستهدف باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون في يرقات الزرد

نقدم هنا، بروتوكول يجتذ يتدنى وراثيا مسماة الخلايا العصبية بليزر اثنين-فوتون من اليرقات الزرد.

الاجتثاث سكان الخلايا العصبية باستخدام ليزر اثنين-فوتون وتقييمها باستخدام الكالسيوم تصوير وتسجيل السلوكية في اليرقات الزرد

الاستئصال بالليزر هو تقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة التجديد في النظم البيولوجية. يصف البروتوكول المعروض استخدام مجهر confocal المسح الضوئي بالليزر القياسي للاستئصال بالليزر والتصوير اللاحق للفاصل الزمني للخلايا المُتدرِّب في الخط الجانبي للحمار الوحشي.

الاستئصال الليزري القائم على المجهر والتجدد في خلايا الحمار الوحشي Interneuromast

يتطلب التطور الجنيني تنسيقا واسع النطاق لحركة الخلية. يسمح الإثارة ثنائية الفوتونيز بالاجتثاث بالليزر بوساطة الاستئصال ثلاثي الأبعاد الذي يتم التحكم فيه مكانيا لمجموعات كبيرة من الخلايا العميقة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه التقنية التحقيق في رد فعل الخلايا المهاجرة بشكل جماعي في الجسم الحي للاضطرابات في بيئتها الميكانيكية.

عمليات الاستئصال العميقة والتحكم المكانية في الحجم باستخدام مجهر فوتونين في زيبرافيش غاسترولا

نقدم بروتوكولا لالتقاط ديناميكيات تجديد زعانف ذيل يرقات الزرد على نطاق كامل من الأنسجة باستخدام الفحص المجهري المجهري القائم على الحقل الساطع. تتيح هذه التقنية التقاط ديناميكيات التجديد بدقة خلية واحدة. يمكن تكييف هذه المنهجية مع أي مجهر مجسمة مزود بكاميرا CCD وبرنامج الفاصل الزمني.

التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

تعلم تقنية استئصال الليزر ثنائي الفوتون لدراسة تجديد العظام في يرقات الزرد. يُظهر هذا البروتوكول دور الاستجابة المناعية في استعادة العظم وآليات الشفاء.

استئصال بانيات العظم بوساطة ليزر ثنائي الفوتون في يرقات الزرد النامية

استكشف المزيد من الفيديوهات