<em>In Vivo</em> Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

Joseph B. Alzagatiti; Luis Salazar; Heidi Brown; Gabriel Rosas; Lama Adel Jaber; Jaime L. Minaya; Courtney Scaramella; Adam C. Roberts; David  L. Glanzman

doi:10.3791/67301

في الجسم الحي التصوير الفلوري متحد البؤر للنشاط العصبي الناجم عن التحفيز الحسي في يرقات ...

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

In Vivo Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

في الجسم الحي التصوير الفلوري متحد البؤر للنشاط العصبي الناجم عن التحفيز الحسي في يرقات الزرد المقيدة جزئيا

Full Text

980 Views

05:12 min

April 18, 2025

DOI: 10.3791/67301-v

Joseph B. Alzagatiti^1,2, Luis Salazar³, Heidi Brown³, Gabriel Rosas³, Lama Adel Jaber³, Jaime L. Minaya³, Courtney Scaramella⁴, Adam C. Roberts³, David L. Glanzman^2,5,6

¹Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology,University of California, Santa Barbara, ²Department of Integrative Biology and Physiology,University of California, Los Angeles, ³Department of Psychology,California State University at Fullerton, ⁴Department of Neuroscience,University of California, Riverside, ⁵Department of Neurobiology,David Geffen School of Medicine at UCLA, ⁶Integrative Center for Learning and Memory, Brain Research Institute,David Geffen School of Medicine at UCLA

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a detailed protocol for examining neural activity in brain regions of transgenic zebrafish expressing GCaMP calcium indicators using confocal microscopy. It aims to investigate dynamic changes in neural activity in response to stimulation, particularly focusing on fluorescence intensity in specific regions.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Neuroimaging
Transgenic models

Background

Transgenic zebrafish models allow for real-time imaging of neuronal activity.
GCaMP indicators provide a method for monitoring calcium fluctuations as a proxy for neural activity.
Confocal microscopy offers high spatial resolution to observe fluorescence intensity changes in neurons.
The protocol allows for precise control of imaging conditions to optimize data acquisition.

Purpose of Study

To develop a robust methodology for assessing GCaMP-mediated neural activity.
To characterize the time-lapse imaging responses in specific neuronal clusters of zebrafish.
To investigate the effects of certain stimuli on neural activity dynamics.

Methods Used

Confocal microscopy was used to visualize neuronal activity in vivo.
Transgenic zebrafish larvae aged 2–7 days post fertilization served as the biological model.
Laid out critical steps for acclimatization and imaging settings.
Included post-imaging analysis using Fiji software for assessing fluorescence intensity.

Main Results

The application of aloe isothiocyanate resulted in increased GCaMP fluorescence, indicating heightened neural activity.
Changes in imaging speed affected spatial and temporal resolution of neuronal visualization.
Normalized fluorescence intensity measurements facilitated the generation of neural traces over time.
Neurons in the hindbrain and spinal cord displayed significant activity changes in response to stimulus.

Conclusions

This study establishes a valuable imaging protocol for analyzing neural dynamics in zebrafish.
Findings enhance understanding of the relationship between stimuli and neuronal behavior.
Insights contribute to the broader comprehension of neural mechanisms and plasticity.

Frequently Asked Questions

What advantages does the zebrafish model offer?

The zebrafish model provides a transparent organism with rapid development, allowing for real-time imaging of neural activity in a living system.

How are the larvae prepared for imaging?

Larvae are embedded in low melting point agarose and positioned dorsal side up in embryo medium before imaging.

What types of data can be obtained?

Data includes time-lapse fluorescence imaging revealing changes in calcium dynamics associated with neuronal activity.

How can the method be adapted for other studies?

The protocol can be modified for various stimuli or fluorescent reporters to investigate different aspects of neural function.

What are some limitations of this technique?

Potential limitations include variations in zebrafish genetics and the challenge of capturing very fast neural activity due to resolution constraints.

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لفحص النشاط العصبي في مناطق الدماغ لأسماك الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن مؤشرات الكالسيوم GCaMP باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

[مدرب] للبدء ، قم بإعداد 3٪ من نقاط الانصهار المنخفضة في وسط الجنين ، وقم بتسخين agros إلى درجة حرارة آمنة للتلاعب بأسماك الحمار الوحشي دون التسبب في ضرر. قبل أن يبرد الغرو ويتصلب ، ضع اليرقات التي تمر بعد يومين إلى سبعة أيام من الإخصاب الجانب الظهري لأعلى في طبق بتري بقاع زجاجي. بمجرد أن تصلب اليرقات في مكانها ، أضف خمسة ملليلتر من وسط الجنين إلى الطبق. باستخدام مشرط ، قم بقطع agros كما هو مطلوب حول اليرقات. انقل طبق بتري مع سمكة الحمار الوحشي إلى مرحلة المجهر متحد البؤر. بعد التأقلم لمدة 20 دقيقة ، استخدم التصوير الساطع لتوسيط الأسماك تحت هدف الغمر في الماء 40 مرة في درجة حرارة الغرفة. قم بتعيين معلمات اكتساب المجهر متحد البؤر بناء على الصفات ومستويات التعبير عن جزيء الفلورسنت ، بالإضافة إلى العمق والخصائص البصرية للأنسجة. اضبط إعدادات طاقة الليزر والكسب الرئيسي لالتقاط ضوء الفلورسنت بشكل صحيح في النطاق الأمثل ومنع الفقدان غير الضروري للتألق المعتمد على نجاح معسكر G ثم قم بتوسيط مجال الرؤية على مجموعة عصبية تقع في الجزء المنقاري من الحبل الشوكي. قم بإجراء مسح ضوئي للسلاسل الزمنية بمجال رؤية 79.86 ميكرومتر مربع بمعدل إطارات 1.20 إطار في الثانية بدقة مكانية تبلغ 0.119 ميكرومتر مربع لكل بكسل. اضبط مجال الرؤية والحجم وسرعة الاكتساب بناء على أهداف التجربة. بعد دقيقتين من بدء التصوير ، أضف 41.67 ميكرولتر من محلول مخزون الصبار أو وسط الجنين إلى الطبق ، واستمر في التسجيل لمدة 30 ثانية تقريبا لمراقبة التغييرات في نشاط G Camp 6 في المنطقة المعنية من خلال التصوير بفاصل زمني. إذا لم يكن الإخراج المسجل بتنسيق ملف TIF النقطي ، فقم بتصدير ملفات الصور كملفات TIF نقطية من مجموعة برامج المجهر لتحليل فيجي النهائي. بعد تنزيل برنامج فيجي لتحليل التتبع العصبي ، افتح فيجي ، واستورد ملفات CZI النقطية إلى البرنامج. استخدم الدائرة أو الأدوات اليدوية في فيجي لتسليط الضوء على منطقة أو خلية عصبية ذات أهمية من خلال النقر على الرموز المعنية. بعد تحديد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار، انقر فوق التحليل والأدوات ومدير العائد على الاستثمار من شريط أدوات فيجي. انقر فوق إضافة T لإضافة عائد الاستثمار المحدد إلى نافذة مدير عائد الاستثمار. في مدير عائد الاستثمار، انقر فوق المزيد وقياس متعدد لتحليل عائد الاستثمار. اترك الإعدادات في الوضع الافتراضي وانقر فوق موافق لإنشاء البيانات الأولية. ثم احفظ الإخراج كملف CSV لمزيد من التلاعب باستخدام Python أو جداول البيانات. الآن قم بتطبيع البيانات الأولية لتمثيلها كأثر عصبي عن طريق حساب متوسط آخر 30 ثانية من التحفيز المسبق لمدة دقيقتين وإنشاء شدة مضان طبيعية باستخدام الصيغة المحددة ورسم البيانات الطبيعية كآثار عصبية. تسبب إعطاء إيزوثيوسيانات الصبار في زيادة مضان G CAMP 6S داخل منطقة دماغية موضعية من يرقات الزرد مما يشير إلى تعزيز النشاط العصبي. بسرعة التقاط بطيئة تبلغ 0.10 إطار في الثانية ، كانت الخلايا العصبية في الدماغ الخلفي والحبل الشوكي مرئية بوضوح بدقة عالية. أدت زيادة سرعة الالتقاط إلى 0.79 إطارا في الثانية إلى فقدان طفيف للدقة المكانية ، ولكن تحسين الدقة الزمنية. عند 3.16 إطارا في الثانية ، بدت الخلايا العصبية أقل تميزا أثناء التقاط المزيد من الديناميكيات الزمنية.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos