تجميع وقياس المزارع المشتركة التي تجمع بين الخميرة غير المتجانسة والبكتيريا الزرقاء التي تفرز السكر الضوئية

يهدف بحثنا إلى فهم الشبكات الميكروبية في الاتحادات الاصطناعية التي تشمل البكتيريا الزرقاء التي تفرز السكروز والفطريات غير المتجانسة. في الماضي ، كان علماء الأحياء الدقيقة يدرسون عادة الثقافات النقية للكائنات الحية الدقيقة المفردة. ومع ذلك ، في الطبيعة ، عادة ما تحدث الميكروبات في اتحادات ، وبالتالي من الضروري أيضا فهم الشبكات الميكروبية في الثقافات المختلطة.

يتمثل أحد التحديات الرئيسية في إيجاد ظروف نمو مناسبة ، بما في ذلك وسيط يسمح بنمو جميع أعضاء الاتحادات. نركز هنا بشكل أساسي على التحسين للحصول على أعلى إنتاج وإفراز للسكروز بواسطة العضو الضوئي ، والذي يوفر الأساس لنمو الأعضاء غير المتجانسة. لتتبع النمو في الثقافات المحورية ، يمكن استخدام تقنيات شائعة مثل قياسات الكثافة البصرية أو التشتت الخلفي.

ومع ذلك ، لا تنطبق هذه التقنيات على الثقافات المشتركة حيث نحتاج إلى عدد الخلايا للأنواع الفردية. في بروتوكولنا ، نطبق مزيجا من الملصقات الفلورية وعد الخلايا للتمييز بين شركاء الزراعة المشتركة المختلفين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا أن نظهر أنه يمكن تحقيق نتائج مماثلة من خلال طرق مختلفة تتراوح من الطرق البسيطة والمنخفضة التكلفة إلى الطرق المكلفة وعالية الإنتاجية.

للبدء ، قم بتكبيل خلايا البكتيريا الزرقاء بعد زراعة الثقافة لمدة ثلاثة أيام. أعد تعليق الحبيبات في 25 مل من وسط CoYBG-11 المعقم. الطرد المركزي العينة على حرارة 4 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب. بمجرد تحديد الكثافة البصرية ، أضف الكمية المحسوبة من CoYBG-11 في قارورة محيرة سعة 250 مليلتر في ظل ظروف معقمة. بعد ذلك ، أضف الأحجام المحسوبة لمعلقات الخلايا الزرقاء وغير المتجانسة لتحقيق حجم ثقافة نهائي يبلغ 50 مل.

استخدم 50 ميكرولترا من مخزون IPTG أحادي المولار لثقافة 50 ملليلترا. ثم ضع القارورة في الحاضنة الضوئية عند حوالي 200 ميكرومول فوتون لكل متر مربع في الثانية. استكمل البيئة ب 2٪ ثاني أكسيد الكربون عند 30 درجة مئوية ، والاهتزاز المداري عند 150 دورة في الدقيقة ، و 75٪ رطوبة.

لأخذ العينات ، أخرج القارورة من الحاضنة وخذ عينة سعة ملليلتر واحد من المزرعة في ظل ظروف معقمة. للتحضير للقياس الكمي المجهري ، تأكد من خلو غرفة العد وزجاج الغطاء من الغبار والخلايا. ضع زجاج الغطاء بشكل صحيح عن طريق تحريكه على قضيبي الدعم بقليل من الضغط مع تجنب الكسر.

بمجرد وضع زجاج الغطاء بشكل صحيح ، راقب حلقات نيوتن بين السطحين الزجاجيين مع التأكد من عدم انزلاق زجاج الغطاء. الآن امزج تعليق الخلية جيدا وقم بتطبيق بضعة ميكرولترات على حافة الغرفة. اسمح للغرفة بالملء بالكامل عن طريق القوة الشعرية.

ثم استخدم هدفا مناسبا للمجهر الضوئي وركز على خطوط شبكة غرفة العد. عد الخلايا في المربعات المناسبة لحجم الخلية المحدد. للقياس الكمي عن طريق عد الجسيمات ، اضبط الكثافة البصرية للعينة على 0.1.

ثم أضف 10 ميكرولترات من العينة إلى 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للقياس متساوي التوتر. قم بتأمين غطاء كوب العينة واخلط العينة برفق عن طريق إمالة الكوب قليلا. بعد وضع كوب العينة في عداد الجسيمات ، أدخل شعيرات دموية بحجم المسام المناسب للخلايا المستخدمة في كوب العينة وأغلق باب الماكينة.

ابدأ القياس وسجل في نطاق مناسب. يمكن تمييز الخلايا ذات أحجام الخلايا المختلفة في هذه المرحلة. للقياس الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي أحادي الخلية ، اضبط الكثافة البصرية للعينات للترتيب المناسب لقياس القياس الخلوي.

قم بتطبيق الصيغة المحددة لضمان بقاء عدد الخلايا في نطاق 1,000 إلى 10,000 خلية في الثانية بمعدل تدفق 10 ميكرولتر في الدقيقة. انقل 300 ميكرولتر من كل معلق خلية عينة إلى بئر فردي في لوح سعة 96 بئرا. ثم انقل اللوحة المكونة من 96 بئرا إلى العينة التلقائية لمقياس الخلوي.

افتح المخططات النقطية والرسوم البيانية لقنوات التألق والمبعثر ذات الصلة بالعينات. لتحديد تركيز الخلية، قم بتسجيل حجم عينة محدد باستخدام وظيفة التسجيل. افصل إشارات الكائنات الضوئية والكائنات غير المتجانسة بناء على التألق الذاتي الأحمر للكائن الضوئي باستخدام الرسم البياني لقناة APC-H.

ثم استخدم الرسم البياني لقناة FITC-H التي تعرض فقط السكان غير المتجانسين لتحديد الخلايا غير المتجانسة التي تحتوي على بروتين فلوري أخضر. استخدم الرسم البياني لقناة PC5.5-H للتمييز بين الخلايا غير المتجانسة التي تحتوي على بروتين الفلورسنت الأحمر وتلك التي لا تحتوي عليه.