نموذج الزراعة المشتركة باستخدام نوعين من خطوط الخلايا الملتصقة

كما يوحي اسم مؤسستنا ، معهد طب الأم والجنين ، يركز بحثنا بشكل أساسي على البيولوجيا الإنجابية للإناث. نهدف إلى فهم آلية الاضطرابات الإنجابية وتحديد الأهداف المحتملة لعلاجها. وتتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا النهج في الانخفاض الكبير في الوقت والنفقات مقارنة بنظم الاستزراع المشترك المتاحة تجاريا.

السقالة محلية الصنع مصنوعة من مواد متاحة بسهولة ، مما يقلل بشكل كبير من تكلفة الإعداد. تمثل هذه النماذج متعددة الخلايا في المختبر بشكل أفضل تشريحا معقدا في الجسم الحي لمنطقة الزرع. في المستقبل ، سيقدم مختبرنا أنواعا أخرى من الخلايا إلى نموذج البذر المختلط متعدد الخلايا في المختبر ، ويحقق في المزيد من دراسات الزرع ووظيفة الرحم في التسبب في أمراض مثل إصابة بطانة الرحم والالتصاق داخل الرحم.

للبدء ، احصل على سقالة مطبوعة ثلاثية الأبعاد لبناء النموذج. لزراعة الخلايا ، ضع غطاء مربعا نظيفا ومعقما مقاس 18 ملم في قاع صفيحة مكونة من 12 بئرا. قم بتغطية الغطاء ب 200 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية بتركيز 200 إلى 300 ميكروغرام لكل ملليلتر.

احتفظ بالطبق عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم قم بإزالة المصفوفة خارج الخلية من اللوحة. بعد ذلك ، افحص الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المزروعة مسبقا وخلايا إيشيكاوا تحت المجهر للتأكد من التقاء مناسب.

ثم قم بإزالة الوسط المستهلك من الآبار ، واغسل الخلايا مرتين بثلاثة ملليلتر من PBS. الآن احتضان الخلايا بملليلترين من إنزيم التفكك عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين لفصلها. تحييد التفاعل باستخدام وسيط ثقافة كامل.

ثم قم بإنشاء تعليق أحادي الخلية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. الآن امزج 100 ميكرولتر من تعليق الخلية مع تريبان الأزرق ، مع الحفاظ على عامل تخفيف قدره اثنين. ثم حرك الغطاء فوق حجرة مقياس الدم.

املأ كلتا الحجرتين الجانبيتين بتعليق الخلية الممزوج باللون الأزرق. احسب عدد الخلايا في المربعات على كلا الجانبين تحت مجهر 20X ، واحسب كثافة الخلية بناء على العدد. الآن زرع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بتركيز 10 إلى قوة خمس خلايا لكل مليلتر في الصفيحة المحضرة التي تحتوي على وسط جديد ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

بالنسبة لخط خلية إيشيكاوا ، قم بزرع الخلايا في البئر دون غطاء في اليوم التالي. انقع السقالات جيدا بالكحول الإيثيلي والماء المقطر المزدوج لمدة يومين. بعد النقع ، قم بإزالة الماء المقطر المزدوج وأغلق العلبة المعدنية.

ثم قم بتعقيم السقالات باستخدام الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية. بعد ذلك ، دعهم يجفوا. أضف ما يقرب من ملليلترين من الوسط التكميلي إلى البئر باستخدام خلايا إيشيكاوا.

انقل الغطاء بالخلايا الجذعية الجنينية البشرية المرفقة على السقالة ، مع وضع جانب الخلية لأسفل. قم بتوصيل السقالة بالبئر التي تحتوي على خلايا إيشيكاوا. بالنسبة للإعداد الثاني ، ضع الغطاء مع خلايا إيشيكاوا على السقالة وقم بتوصيله بالبئر الذي يحتوي على الخلايا الجذعية الجنينية.

احتضان أنظمة الاستزراع المشترك عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإزالة وسط الثقافة بعناية من الآبار ، واشطف الخلايا برفق باستخدام PBS المعقم. باستخدام ملقط أو ملاقط دقيقة ، قم بإزالة الغطاءات ذات الخلايا المرفقة من أطباق الاستزراع.

اختياريا ، ضع الأغطية في طبق جديد مع PBS للحفاظ على رطوبتها أثناء عملية النقل. أضف قطرة من PBS على شريحة مجهر نظيفة ، وانقل الغطاء الذي يحتوي على الخلايا برفق إلى القطرة ، مع التأكد من أن الخلايا متجهة لأسفل على الشريحة. ضع الشريحة المعدة على مسرح المجهر المقلوب.

حدد عدسة الهدف المناسبة ، واستخدم مقابض التركيز البؤري الخشنة والدقيقة لضبط التركيز البؤري. اضبط معلمات المجهر، بما في ذلك شدة الإضاءة وإعدادات الكاميرا. استخدم برنامج المجهر لالتقاط الصور بالتكبير ومجالات الرؤية المطلوبة.

ظلت كثافة كلا النوعين من الخلايا منخفضة في حالة الزراعة المشتركة بعد 72 ساعة ، بينما زادت كثافة الخلايا المزروعة بشكل مستقل بشكل كبير. كان طول الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المستزرعة بشكل مشترك أقصر من تلك التي تم زراعتها بشكل مستقل.