العزل وتسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة للخلايا الدبقية الصغيرة الحصين من الفئران البالغة

يركز بحثنا على عزل الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل حاد لتسجيلات الخلية الكاملة ، بما في ذلك تيارات البوتاسيوم لفهم نشاط القناة الأيونية. البروتوكول قابل للتكيف أيضا لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة لمناطق الدماغ المختلفة ، مما يوفر رؤى حول الصفر عبر حالات الأعصاب المختلفة.

تشمل أحدث التطورات في مجال بحثنا استخدام هضم إنزيم التهاب البنكرياس التقليدي ، جنبا إلى جنب مع تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال فرز الخلايا النشطة الفلورية. عززت هذه التطورات دقة وكفاءة عزل مجموعات معينة من الخلايا الدبقية الصغيرة لمزيد من الدراسة.

يبحث بروتوكولنا في الخصائص الكهربية الفسيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة مباشرة من الحصين الفأر البالغ ، بدلا من الاعتماد على CS المزروع الأولي. يسمح هذا النهج بتحليل أكثر دقة لوظائف الخلايا الدبقية الصغيرة في بيئتها الأصلية.

مهدت نتائجنا الطريق لأسئلة علمية جديدة حول الخصائص الكيميائية الحيوية والوظيفية للخلايا الدبقية الصغيرة في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية ، مما يوفر للباحثين إرشادات قيمة في استكشاف هذه الجوانب بشكل أكبر.

[مقدم العرض] للبدء ، ضع المخدر على طاولة تشريح وقم بتثبيت أطرافه. كشف الصدر وقم بتقويم القلب باستخدام PBS المثلج والمعقم لإزالة خلايا الدم المنتشرة داخل الأوعية الدموية. ثم أمسك الرأس واقطع الجلد على طول خط الوسط في الدماغ بالمقص لفضح الجمجمة. بعد ذلك ، قم بقص الجزء الخلفي من الجمجمة بشكل ثنائي وبين تجاويف العين بمقص صغير. قطع الجمجمة على طول خياطة السهمية وإزالة الجمجمة بالملاقط. بعد ذلك ، استخرج أنسجة المخ بسرعة. الآن ، ضع أنسجة المخ في أطباق ثقافة بطول 10 سم تحتوي على PBS مثلج. تشريح القشرة الدماغية ثنائيا باستخدام الملقط. اعزل أنسجة الحصين وتقطيعها إلى قطع أصغر. انقل القطع إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. ثم أعد تعليق القطع الصغيرة من أنسجة الحصين في ملليلترين من محلول الملح المتوازن هانكس المثلج أو HBSS. وجهاز طرد مركزي عند 300 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 1,950 ميكرولتر من خليط الإنزيم واحد إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر الذي يحتوي على قطع أنسجة الحصين. رج أنبوب الطرد المركزي باستمرار في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من خليط الإنزيم المحضر حديثا إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل. ماصة شظايا الأنسجة لأعلى ولأسفل 20 مرة بطرف ماصة سعة مليلتر واحد واحتضانها في حمام مائي لمدة خمس دقائق مع الاهتزاز المستمر عند 37 درجة مئوية. بعد إزالة أنبوب الطرد المركزي، قم بتحريك المعلق لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد حتى تختفي قطع الأنسجة الكبيرة. ثم قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مرشح فحص خلية 70 ميكرومتر وجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 ملليلترا. انقل المرشح إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم تخلص من المادة الطافية بماصة سعة مليلتر واحد. الآن ، قم بتعليق الخلية لأعلى ولأسفل 20 مرة مع 15 مل من HBSS لغسلها وجهاز الطرد المركزي عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا. للبدء ، قم بنقل مليلتر واحد من المعلق أحادي الخلية المحضر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر وجهاز طرد مركزي عند 300 جم لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. بمجرد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات أحادية الخلية في 90 ميكرولتر من فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا أو الحد الأقصى للمخزن المؤقت. أضف 10 ميكرولترات من الميكروبيدات CD11b أو c واحتضن التعليق عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على شاكر أفقي. ثم أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت الأقصى مباشرة إلى الأنبوب لغسل التعليق أحادي الخلية. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الأقصى. باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد، انقل معلق الخلية المعاد تعليقها إلى عمود الفرز في المجال المغناطيسي. بينما يبقى في المجال المغناطيسي ، اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الأقصى. ثم قم بإزالة عمود الفرز من المجال المغناطيسي. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت الأقصى إلى العمود وادفعه ببطء باستخدام المكبس. اجمع التدفق من خلال. الآن ، قم بزرع الخلايا المختارة في صفيحة من 24 بئرا تحتوي على زلة غطاء مطلية ب Poly-L-lysine. أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع واحتضنه لمدة 20 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 60 إلى 80٪ رطوبة. للبدء ، خذ الخلايا الدبقية الصغيرة المزروعة المعزولة من أنسجة دماغ الفئران. حدد موقع الخلايا الدبقية الكروية تحت مجهر مائي باستخدام هدف 40x. بعد ذلك ، املأ القطب بمحلول داخل الخلايا وقم بتوصيله بمرحلة رأس مكبر الصوت لإعداد الفيزيولوجيا الكهربية. تطبيق ضغط إيجابي. قم بالتبديل إلى الهدف 4x وحدد موقع القطب. ثم اخفض القطب الكهربائي في محلول الحمام. اضبط مكبر الصوت على وضع مشبك الجهد لإجراء اختبار الغشاء في وضع الحمام. بعد ذلك ، ارجع إلى هدف 40x وحرك طرف القطب بالقرب من الخلايا الدبقية الصغيرة. بعد ذلك ، قم بتطبيق ضغط سلبي صغير لتثبيت الخلية. عندما تصل المقاومة إلى 100 ميغا أوم ، قم بالتبديل من وضع الحمام إلى وضع التصحيح في اختبار الغشاء. عندما تصل المقاومة إلى 300 ميغا أوم ، حرر الضغط السلبي. عندما تشير المقاومة إلى تكوين ختم جيجا أوم بين القطب الكهربائي والغشاء الدبقي الصغير. قم بالتبديل من وضع التصحيح إلى وضع الخلية في اختبار الغشاء. ثم ضع كمية صغيرة من الشفط وابدأ صدمة كهربائية لتمزق الغشاء. بعد ذلك قم بالتبديل إلى وضع مشبك الجهد ، افتح برنامج التسجيل وسجل تيارات البوتاسيوم لمدة 200 مللي ثانية.