الكشف عن بروتيوفورمات هيستون باستخدام الرحلان الكهربائي للجل 2D-TAU

تركز جهودنا حاليا على توصيف العلاقة الحالية بين التغيرات اللاجينية وإعادة الأسلاك الأيضية بشكل أفضل ، مع الهدف النهائي المتمثل في تحديد الأهداف العلاجية اللاجينية الجديدة. نظرا للطبيعة الديناميكية والقابلة للعكس للتعديل اللاجيني ، تم مؤخرا تطوير العديد من عوامل الأدوية epi ، مما يؤدي إلى تحسين علاج السرطان وتقليل مقاومة العلاج الكيميائي. في الآونة الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير في مجال توصيف المثيل ، وذلك بفضل تطبيق قياس الطيف الكتلي الحديث ، إلى جانب تقنيات الفصل ، مثل الصفحة العلوية أو الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء.

يتمثل التحدي الرئيسي في توصيف هيستون في وجود أشكال هيستون بروتينية لا تعد ولا تحصى ، ناتجة عن الحديث المتبادل بين الإنزيم الديناميكي المعدل وتوافر المستقلبات. ابدأ بإعداد جل TAU صغير لجل بولي أكريلاميد عمودي صغير ، نظام الرحلان الكهربائي. للقيام بذلك ، قم بإذابة ستة يوريا مولية في محلول 15٪ من مادة الأكريلاميد ثنائية الأكريلاميد ، ومليلتر واحد من الماء عالي النقاء تحت تحريض لطيف في درجة حرارة الغرفة.

ثم أضف المكونات الأخرى واضبط مستوى الصوت. املأ ألواح الجل المعدة مسبقا بهذا المحلول ، مع ضمان عدم تكوين فقاعات هواء ، وترك 1.5 سم من الأعلى. أضف ملليلتر واحد من الأيزوبروبانول في الأعلى لتسوية الجل.

لتحضير هلام التكديس المذاب ، قم بإذابة اليوريا في 6٪ أكريلاميد ، ثنائي أكريلاميد مع مليلتر واحد من الماء عالي النقاء. بعد إضافة المكونات الأخرى ، املأ ألواح الجل بهذا المحلول وأدخل مشطا بسعة 10 جيدا بين الألواح حتى يصل المحلول إلى منتصف أسنان المشط. بعد ذلك ، قم بإذابة ستة يوريا مولية ، و 5٪ من حمض الخليك الجليدي ، والماء المقطر المزدوج لتحضير 100 ميكرولتر من عينة TAU.

ثم قم بإذابة عينة الهيستون المجففة بالتجميد في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة TAU. املأ الكاسيت الصغير بمخزن مؤقت تشغيل TAU بتركيز نهائي يبلغ 5٪ من حمض الأسيتيك. استخدم حقنة لشطف آبار الجل بمحلول تشغيلي ، وقم بتحميل العينة في الآبار باستخدام ماصة دقيقة.

ثم قم بتوصيل غرفة الرحلان الكهربائي بمصدر الطاقة ، مع وضع القطب الموجب في الأسفل. من حين لآخر ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة واشطف آبار الجل بحقنة لإزالة الفقاعات من السطح السفلي للجل. بعد إزالة الجل من ألواح الجل ، قم بقطع حارة الاهتمام باستخدام مشرط نظيف.

الآن اغسل حارة الجل ب 15 مل من 0.5 متر تريس هيدروكلوريد ، درجة الحموضة 8.8 لمدة 15 دقيقة. قم بإعداد 15 مل من المخزن المؤقت للتوازن الأول والثاني ، باستخدام المكونات الموضحة هنا. ثم قم بتخزين المخزن المؤقت للتوازن اثنين في الظلام.

الآن ، احتضن حارة الجل في 10 ملليلتر من مخزن التوازن مع تحريك لطيف لمدة 15 دقيقة ، ثم صبها. بعد ذلك ، قم باحتضان حارة الجل في 10 ملليلتر من مخزن مؤقت للتوازن اثنين تحت التحريض اللطيف لمدة 15 دقيقة في الظلام قبل صبه. بعد ذلك ، قم بإعداد جل حل مادة الأكريلاميد بنسبة 15٪ ، باستخدام التركيبة الموضحة هنا.

قم بإعداد لوحة الجل واملأها بمحلول الجل القابل للحل ، مع ترك 1.5 سم من نهاية لوحة الجل الطويلة. أضف ملليلترا واحدا من الأيزوبروبانول في الأعلى لتسوية الجل والسماح له بالبلمرة. بمجرد أن يتبلمر الجل ، قم بصب الأيزوبروبانول وجفف البئر باستخدام ورق كروماتوغرافيا السليلوز بثلاثة مم.

أدخل ممر الجل المقطوع في بئر الجل المحلل ، باستخدام ملاقط لمنع فقاعات الهواء ، ثم أغلق ممر الجل بالجل المحلل ، باستخدام 0.5٪ نقطة انصهار منخفضة agarose في tris glycine و SDS buffer ، مع خمسة ميكرولتر من 0.003٪ بروموفينول أزرق. ضع ألواح الجل في الكاسيت واملأها ب tris glycine و SDS buffer. قم بتشغيل الجل على 120 فولت حتى تصل صبغة البروموفينول الزرقاء إلى القاع.

بعد الجري ، قم بإزالة الجل برفق من الألواح وتخلص من الاغاروز الزائد. للبدء ، قم بإجراء جل صغير ثنائي الأبعاد حمض تريتون ، أو الرحلان الكهربائي TAU على عينات هيستون ، متبوعا بتلطيخ الفضة. ثم قم بإعداد الكواشف الموضحة هنا.

باستخدام مشرط نظيف ، قم بإزالة بقع الهيستون ذات الأهمية من الجل الملون ، وضع كل بقعة في أنبوب سيليكون جديد سعة 1.5 مل لتجنب التلوث المتساوي الشكل. أضف 250 ميكرولترا من بيكربونات الأمونيوم 50 مللي مولار ، أو 50٪ نيترو الأسيتون إلى كل بقعة هلامية واحتضانها تحت التحريك اللطيف في الخلاط الحراري في درجة حرارة الغرفة. صب المحلول وكرر هذه العملية ثلاث مرات حتى تظهر قطع الجل شفافة.

لتجفيف بقع الهلام ، أضف 200 ميكرولتر من نيترول الأسيتون. خلال هذه الخطوة ، ستتحول قطع الجل إلى اللون الأبيض المعتم. صب نتريل الأسيتون ، واترك بقع الجل تجف في الهواء لمدة 10 دقائق.

ستظهر قطع الجل جافة في الأنابيب. بعد ذلك ، أعد ترطيب بقع الجل عن طريق إضافة 20 ميكرولترا من محلول التربسين أو حجم كاف لتغطية قطع الجل. احتضان الأنابيب في خلاط حراري عند 37 درجة مئوية تحت تحريض لطيف لمدة أربع ساعات على الأقل وحتى 16 ساعة.

انقل المادة الطافية التي تحتوي على الببتيدات ثلاثية الصبغة إلى أنبوب جديد. أضف 50 ميكرولترا من محلول الاستخراج إلى قطع الجل وصوتنة مرتين في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية التي تحتوي على الببتيدات الثلاثية الإضافية إلى نفس الأنبوب الجديد.

استخدم مجفف التجفيد لتجفيف الببتيدات المستخرجة المجمعة عند 30 درجة مئوية. سوف تتشكل حبيبات مجففة بالتجميد في الأنبوب. الآن ، أضف 15 ميكرولترا من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 0.1٪ إلى كل أنبوب ، واحتضنه برفق في خلاط حراري عند 25 درجة مئوية.

انقل المادة الطافية إلى قارورة للترادف للكروماتوغرافيا السائلة ، وتحليل الطيف الكتلي.