القياس الكمي لتعديل نشاط إنزيم الإيلاستاز من خلال التحليل اللوني

يركز نطاق بحثنا على تطوير المركبات التفاعلية الطبيعية. لذلك باستخدام طريقة المختبر ، نهدف إلى تقييم نشاط الإيلاستاز ، وهو إنزيم يشارك في تحلل الإيلاستين وفقدان المرونة ، من أجل استعادة توازن الأنسجة. يمثل القياس الكمي للمستخلصات النباتية الطبيعية ، وهو النشاط ، العديد من التحديات ، تتعلق بشكل أساسي بتركيبها الكيميائي المعقد وتلوينها القوي في كثير من الأحيان الذي يمكن أن يتداخل مع القياسات الشائعة.

يعد تطوير بروتوكولات تكيفية موثوقة أمرا حيويا للنهوض بهذا المجال البحثي. تقدم دراستنا العديد من الفوائد للمجالات ، بما في ذلك البساطة والحساسية والنتيجة السريعة للتوتر والقدرة على التكيف مع الاحتياجات البحثية المختلفة. للبدء ، قم بوزن الكمية المناسبة من قاعدة تريس باستخدام ميزان تحليلي وانقل قاعدة تريس الموزونة إلى كوب.

باستخدام أسطوانة متدرجة ، أضف الماء منزوع الأيونات إلى الدرق. قلب المحلول باستخدام محرك مغناطيسي حتى تذوب قاعدة تريس تماما. ثم اضبط درجة الحموضة في المحلول على ثمانية باستخدام أربعة حمض هيدروكلوريك عادي.

بمجرد الوصول إلى الرقم الهيدروجيني المطلوب ، انقل المحلول إلى قارورة حجمية. باستخدام الماء منزوع الأيونات ، املأ القارورة بالحجم المحدد. انقل المخزن المؤقت المحضر إلى زجاجة تخزين تحمل علامة وقم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة.

لتحضير العينة، قم بوزن الكمية المطلوبة من العينة بدقة باستخدام ميزان تحليلي. قم بإذابة العينة في المخزن المؤقت للتفاعل المحضر لتحقيق التركيز المطلوب. استخدم خلاط دوامة لإذابة العينة بالكامل.

وتخزين العينة المحضرة على الثلج. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول عملي من إنزيم الإيلاستاز في المخزن المؤقت للتفاعل إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل مليلتر. قم بتخزين محلول الإيلاستاز على الثلج حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

الآن قم بإعداد محلول SANA 0.8 ملليمولار في المخزن المؤقت للتفاعل. احم المحلول من الضوء وقم بتخزينه على درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. بالنسبة لفلوريد فينيل ميثان سولفونيل ، أو مخزون PMSF ، قم بإعداد محلول PMSF 100 مللي مولار في الأيزوبروبانول.

قم بتخزين المحلول المحضر على الثلج. تحضير جميع التفاعلات ثلاث نسخ باستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. احتضان جميع الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة SANA إلى كل أنبوب ، باستثناء عناصر التحكم في الألوان. اقلب الأنابيب برفق عدة مرات لخلط العينات ونقل 300 ميكرولتر من كل أنبوب إلى صفيحة 96 بئرا ، مما يضمن قياسات ثلاثية لكل عينة. أخيرا ، ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا في قارئ صفيحة دقيقة مضبوطة على 410 نانومتر ، وقم بقياس الامتصاص بشكل دوري ، كل دقيقة لمدة 20 دقيقة ، أو حتى تستقر الإشارة في درجة حرارة الغرفة.

أظهر المستخلص الأول نشاطا مثبطا للإيلاستاز ضعيفا ولكنه كبير بتركيزات واحد و 0.75 و 0.5 ملليغرام لكل مليلتر ، مع عدم وجود تأثير كبير عند 0.25 ملليغرام لكل مليلتر. أظهر مستخلص اثنين نشاطا مثبطا عالي للإيلاستاز في جميع التركيزات المختبرة ، مع مستويات تثبيط مماثلة للتحكم الإيجابي عند واحد ، 0.75 ، و 0.5 ملليغرام لكل مليلتر.