التصوير الطولي داخل الحيوية لديناميكيات الأوعية الدموية في نخاع عظم الجلسنة

يركز هذا البحث على فهم ديناميكيات الأوعية الدموية في البيئة الكبيرة لنخاع العظم باستخدام الفحص المجهري داخل الحيوية ، بهدف الكشف عن كيفية استجابة الأوعية الدموية لتكون الدم الطبيعي والمرضي. نحن نستخدم تقنيات تصوير متقدمة مثل الفحص المجهري الضوئي ، والنماذج الحيوانية المعدلة وراثيا ، ونحلل جهاز التتبع لتصور وقياس التغيرات الديناميكية في الأوعية الدموية في الأنسجة الحية بمرور الوقت. التقدم الرئيسي هو تحسين بروتوكولنا لتحسين رفاهية والتوافق مع ثلاثة Rs. يقلل نهجنا الطولي من الخطوات الجراحية ويقلل بشكل كبير من عدد اللازمة لدراستنا.

يعالج بروتوكولنا الحاجة إلى التصوير غير السام وطويل الأمد داخل الحيوية باستخدام مجهر ثنائي الفوتون ، والذي يسمح باختراق الأنسجة العميقة والتصور عالي الدقة لسلوك الخلية وتفاعلها. سيجعل استخدام غرسة الرأس المطبوعة ثلاثية الأبعاد من السهل جدا العثور على منطقة الاهتمام أثناء جلسة التصوير الطولي دون الهدف إلى تغيير الارتفاع أو الزاوية أو الترتيب. نحن نستخدم حاليا هذا البروتوكول لتتبع أنواع فرعية بطانية محددة واستجابتها لتطور سرطان الدم والعلاج الدوائي لفهم مساهمتها في التسبب في المرض بشكل أفضل.

للبدء ، قم بتشغيل برنامج التجزئة واستيراد ملفات micro-CT DICOM لعزل الجمجمة. قم بإجراء تجزئة قائمة على العتبة لفصل أنسجة العظام عن الهياكل المحيطة. اضبط المناطق المعقدة أو الصاخبة يدويا لتحسين التجزئة.

في 3D Slicer ، قم باستيراد ملفات DICOM وقم بتحميل مجموعة البيانات. راقب شرائح التصوير المقطعي المحوسب في طرق عرض الشريحة المحورية والسهمية والإكليلية. افتح محرر الشرائح وانقر على إضافة لإنشاء تقسيم جديد، ثم انقر على إضافة مرة أخرى لإنشاء شريحة جديدة للحد الأدنى.

في لوحة محرر المقطع، انقر على تأثير العتبة. اضبط منزلقات العتبة السفلية والعليا أو أدخل قيما رقمية لتمييز المنطقة المجزأة باللون الأحمر. لتصدير الجمجمة المجزأة كملف stl ، قم بالتبديل إلى وحدة التجزئة.

تأكد من تحديد المقطع المحدد. في قسم نماذج التصدير/الاستيراد وخرائط التسميات، قم بتعيين نوع التصدير إلى النماذج وتنسيق الملف إلى stl، ثم انقر فوق تصدير لحفظ الملف. لإعداد نموذج الجمجمة في CAD ، قم أولا باستيراد نموذج الجمجمة المبسط بتنسيق stl إلى برنامج CAD كجزء أو نموذج جديد.

في المستوى المتوسط ، قم بإنشاء محور عرضي للكالفاريا ، ثم احفظ نموذج الجمجمة المعد. قم بإنشاء رسم تخطيطي في المستوى الجلجوري وصمم شريحة على شكل كمثرى من AP زائد 6.5 إلى سالب اثنين. بعرض ستة ملليمترات عند AP 0.0 ، سيكون هذا هو محيط السطح الذي يمكن ملاحظته.

صمم ذيل الغرسة مع التأكد من توافقه مع بنية الجمجمة للتثبيت المناسب مع احترام الحجم المتاح. أخيرا ، قم بإنشاء غطاء واقي لحماية نافذة المراقبة عندما لا تكون قيد الاستخدام. ضع فأرة مخدرة على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية وراقب معدل التنفس بصريا.

احلق رأس الماوس بماكينة حلاقة كهربائية. ثم ضع قطرة من جل العيون على عيون الفأر. تأكد من إزالة كل الشعر لمنع القطع الأثرية التصويرية وتقليل خطر الإصابة بعدوى الجروح.

الآن ، استخدم زوجا من الملقط والمقص المعقم لعمل شق صغير في الجزء المركزي من فروة الرأس لكشف ندبة العظام المركزية. قم بإزالة النسيج الضام بين الجمجمة وفروة الرأس. امزج كمية كافية من الأسمنت السني في طبق بتري لعمل عجينة.

قم بتطبيقه بسرعة على الجزء السفلي من غرسة تثبيت الرأس. دون السماح للأسمنت السني بالدخول إلى منطقة التصوير ، ضع حامل الرأس على الجمجمة المكشوفة واتركها ثابتة. قم بتشغيل تدفق الأيزوفلوران باتجاه القناع التجسيمي للمجهر.

الآن ، أحضر الماوس بسرعة إلى المجهر. أدخل أسنان الفأر بعناية في القناع لضمان اختراق الأيزوفلوران بشكل صحيح عن طريق رفع أنفه بيد واحدة. أثناء الإمساك بالماوس بيد واحدة ، قم بتمرير تشابك غرسة تثبيت الرأس برفق في حامل التثبيت باستخدام اليد الأخرى.

قم بتثبيته بنصف دورة من المقبض اللولبي. بعد ذلك ، أدخل مسبارا مستقيميا مضمنا مسبقا بجل مائي لمراقبة درجة حرارة الماوس. املأ حجرة تصوير الرأس بكمية كبيرة من الجل المائي أو PBS.

قم بخفض هدف الغمر في الماء حتى يتم غمره بالكامل للحصول على الإثارة المثلى واكتشاف الإشارة أثناء الإثارة ثنائية الفوتون. حرك المرحلة x و y ومحرك z للتركيز على العظم المركزي في ندبة السقالة. تحديد الأنسجة المميزة بسطح العظم والوريد المركزي.

أطفئ الضوء في الغرفة وأغلق الصندوق حول حامل المجهر. بعد تفعيل أجهزة الكشف غير TOSCAN. اضبط PMT1 للكشف عن SHG الثاني عند 423 إلى 461 نانومتر ، وارتفاع D2 ل GFP عند 485 إلى 548 نانومتر ، وارتفاع D3 ل TD D'Amato عند 551 إلى 645 نانومتر.

اترك الإزاحة عند الصفر. الآن ، اضبط كسب PMT SHG على 850 فولت ومكاسب D العالية عند 100٪ قم بزيادة طاقة الليزر بالأشعة تحت الحمراء حتى تظهر صورة بنطاق ديناميكي يبلغ 200 مستوى رمادي على أدنى القنوات الثلاث. في برنامج الاستحواذ ، يشار إلى منطقة تحديد المواقع التي تحتوي على جيوب نخاع العظم ، مغلفة داخل أسطح العظام.

لتحديد مناطق الاهتمام المختلفة ، أو عائد الاستثمار ، قم بتنشيط Loss Navigator وإنشاء نظرة عامة باستخدام الوضع الحلزوني. انقر فوق أيقونة الصورة الفردية لتسجيل مواضع عائد الاستثمار المحددة وإعادة تسمية كل موضع في قائمة المهام. للحصول على وحدة تخزين مكدس Z، حدد وضع المكدس Z وحدد حجم الخطوة عند ثلاثة ميكرومترات.

قم بإلغاء تحديد نفس حجم المكدس لجميع المناطق، ثم اضغط على بدء للبدء ومن النهاية إلى النهاية. بعد الالتقاط، انقر فوق إعادة تعريف المكدس. اضغط على ابدأ لبدء جمع الصور وحفظ الصور في المجلد المناسب.

لقياس ميزة ديناميكية ، مثل نفاذية الأوعية الدموية ، قم بتغيير وضع الاستحواذ إلى XYZT للحصول على فاصل زمني. في الوحدة T ، اضبط الفاصل الزمني إلى ثلاث دقائق والمدة إلى ساعة واحدة. الآن ، قم بحقن 100 ميكرولتر من 70 كيلو دالتون ديكستران TRITC عن طريق الوريد بتركيز أربعة ملليغرام لكل مليلتر ، وابدأ في الاستحواذ.

بعد نقل الفأر إلى علامة الجراحة على وسادة تسخين 37 درجة مئوية ، ضع الجل داخل الموقع على الجمجمة للحفاظ على رطوبتها. أغلق منطقة التصوير لغرسة الرأس بالغطاء المحدد وقم بتأمين الغطاء بعناية باستخدام المسمار. ضع الماوس في صندوق التسخين المضبوطة على 37 درجة مئوية وانتظر حتى يستيقظ.

بمجرد أن يتعافى الفأر تماما ، انقله إلى منشأة ووضعه في قفص نظيف مع هيدروجيل وإثراء بيئي. لعمليات الاستحواذ الطولية ، ضع قطرة صغيرة من جل العيون على عيون الفأر مع حامل رأس مثبت بالفعل. احصل على صورة النظرة العامة كما هو موضح سابقا.

إذا لزم الأمر، أعد محاذاة الصور السابقة والجديدة باستخدام وحدة التحميل ومحاذاة الصورة. افتح صورة التقاط الشاشة لتحديد المواضع في مكانها الأصلي. تم تصميم نموذج CAD لغرسة تثبيت رأس التيتانيوم لتتوافق مع البنية التشريحية للجمجمة ، مما يضمن ارتباطا ثابتا بمرحلة المجهر للتصوير الخلوي.

تم ربط الغرسة بنجاح بجمجمة الفأر ومكنت من التصوير المستقر بمرور الوقت ، مع السماح للفأر بالحفاظ على الأنشطة العادية. تم تصور الأوعية الدموية لنخاع العظم الجلجوري باستخدام مسح البلاط ، مما كشف عن شبكة معقدة من الشرايين والشعيرات الدموية الانتقالية والجيوب الأنفية. أظهر التحليل الكمي للأوعية الدموية تجزئة هياكل الأوعية الدموية ، مما يسمح بقياس قطر الوعاء وطوله واستقامته وارتباطهما.

التقط التصوير الطولي إعادة تشكيل تدريجية للأوعية الدموية أثناء تطور سرطان الدم مع زيادة كثافة الأوعية الدموية التي لوحظت بمرور الوقت. تم تقييم نفاذية الأوعية الدموية ديناميكيا ، مما يدل على الاحتفاظ التفاضلي للصبغة الفلورية بمرور الوقت ، مما يعرض نفاذية تفاضلية لأوعية نخاع العظام المختلفة.