دراسة متعددة الوسائط لإعادة تشكيل القلب والأوعية الدموية في الفئران: التصوير بالموجات فوق الصوتية رباعية الأبعاد وقياس الطيف الكتلي

يستخدم مختبرنا التصوير بالموجات فوق الصوتية قبل السريرية لدراسة الميكانيكا الحيوية للقلب والأوعية الدموية في مختلف الأمراض والحالات الفسيولوجية. نستخدم أيضا تصوير قياس الطيف الكتلي لدراسة التوزيع المكاني للدهون في أنسجة القلب والأوعية الدموية والدماغ. نحن نحاول أن نرى أين لدينا تغيرات وظيفية وجزيئية في الأنسجة.

على الرغم من أن تقنيات التصوير الجزيئي الشائعة ، مثل علم الأنسجة والكيمياء المناعية ، يمكن أن تنتج بيانات جزيئية ، إلا أنها محدودة بالبقع والأجسام المضادة المتاحة حاليا. من ناحية أخرى ، يعد تصوير قياس الطيف الكتلي نهجا غير مستهدف للدراسات متعددة الأوم التي لا تزال تحافظ على السلامة المكانية للأنسجة. باستخدام تقنيتنا ، يمكننا توسيع الطابعات متعددة الأوم لتشمل الدهون والجليكان والببتيدات ، وإقرانها بتقنيات التصوير الوظيفي ، مثل الموجات فوق الصوتية.

باستخدام هذه التقنيات ، يمكن للباحثين الآن الجمع بين التصوير الوظيفي وتقنيات التصوير الجزيئي. في مختبرنا ، لدينا مجالان رئيسيان للتركيز على أمراض القلب والأوعية الدموية ، أحدهما يبحث في إعادة تشكيل القلب بالنوبات القلبية أو علاجات السرطان ، وبالتالي السمية القلبية. وهدفنا الثاني الكبير للقلب والأوعية الدموية هو النظر في الشيخوخة وكيف تؤثر الشيخوخة على الأوعية الدموية.

لإجراء الموجات فوق الصوتية للقلب رباعي الأبعاد ، ضع الماوس في وضع ضعيف على لوحة التصوير. ثم ضع محول الطاقة في الحامل في وضع شبه مغلق. قم بمحاذاة النقطة المرتفعة على محول الطاقة مع النقطة الزرقاء على الشاشة ، ووضعها في اتجاه الجانب الأيمن للماوس.

أدر محول الطاقة لمحاذاة المستوى السهمي للماوس مع توجيه الشق المرتفع بشكل ذيلي. ضع كمية وفيرة من هلام الموجات فوق الصوتية على السطح البطني للتجويف الصدري للاقتران الصوتي مع محول الطاقة. اخفض محول الطاقة حتى يلامس هلام الموجات فوق الصوتية.

قم بإجراء تعديلات دقيقة باستخدام مقابض XY الموجودة في قاعدة اللوحة للضبط الدقيق. بعد ذلك ، تأكد من أن عرض المحور الطويل على الشاشة يتضمن القمة ومسار تدفق البطين الأيسر والشريان الأورطي ، محاذاة أفقيا للحصول على تصوير دقيق. حدد اسم الصورة في الزاوية السفلية من الشاشة لحفظ الصورة في السلسلة الحالية.

قم بتدوير محول الطاقة 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة للحصول على عرض قصير المحور القصير. تأكد من تحديد البطين الأيسر بوضوح في الصورة وأن العضلات الحليمية مرئية. حدد رمز المكعب في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة لإعداد صورة رباعية الأبعاد.

بعد إعادة ضبط محول الطاقة ، اضبط موضع البدء على أسفل القمة مباشرة وموضع التوقف إلى القوس الأبهري. اضبط حجم الخطوة على 0.08 إلى 0.13 ملم ومعدل الإطارات على 200 إلى 300 هرتز. تأكد من بقاء العلامات الحيوية وإشارة مخطط كهربية القلب مستقرة قبل بدء الفحص.

بعد الانتهاء من الفحص والمعالجة ، قم بتشغيل حفظ بيانات EKV / 4D وبوابة التنفس للمعالجة اللاحقة. حدد اسم الصورة في الزاوية اليمنى السفلية وقم بتضمين معرف الماوس في الاسم. لتصور كل مستوى عرض من خلال الدورة القلبية، حدد المزيد من عناصر التحكم، واختر تحميل في رباعي الأبعاد.

راجع كل عرض مستوي للقلب ، مع التأكد من أن مركز القلب يظل مستقرا طوال الدورة القلبية. للبدء ، قم بإعداد قوارب رقائق الألومنيوم للتجميد السريع لأنسجة الفئران. باستخدام الملقط ، ضع خيمة على جلد الفأر القتل رحيم واقطع جلد الخيام بمقص على الرقبة للوصول إلى الأوعية الدموية أو أسفل القص مباشرة للوصول إلى القلب.

استمر في قطع طبقات الجلد والعضلات لكشف الأوعية الدموية. لإزالة القلب ، اقطع العظام لكشف القلب. باستخدام تشريح حاد باستخدام مسحات قطنية ، اعزل القلب أو الأوعية الدموية عن الأنسجة المحيطة ، بما في ذلك الدهون.

افصل الوعاء السباتي بعناية عن العصب. ثم قم بإزالة القلب أو الأوعية الدموية باستخدام الأدوات الجراحية. ضع وعاء الشريان السباتي والقلب والأوعية الدموية على قارب رقائق الألومنيوم المسمى مسبقا.

ثم ضع القوارب في النيتروجين السائل للتجميد السريع. للبدء ، املأ دورق بماء HPLC وضعه جانبا مع محاقن سعة خمسة وواحد ملليلتر. ثم اضبط درجة حرارة ناظم البرد على 25 درجة مئوية تحت الصفر وأدخل الشفرة.

ضع زوجا من الملقط داخل حجرة ناظم البرد لتبرد قبل تركيب الأنسجة. اسحب خمسة ملليلتر من ماء HPLC في حقنة وضعها في ناظم التبريد لتجميد الماء جزئيا. قبل أن يتجمد الماء الموجود في المحقنة تماما ، قم بتوزيعه على ظرف المعدن واتركه يتجمد تماما.

الآن ، املأ حقنة سعة ملليلتر واحد بماء HPLC وضعها في ناظم البرد. بعد 30 إلى 60 ثانية ، ضع قطعة صغيرة من الماء المتصلب جزئيا في وسط الظرف باستخدام الملقط ، ضع قلب الفأر المستخرج بسرعة في قطرة الماء واحتفظ به هناك حتى تتجمد المياه المحيطة تماما.

للبدء ، قم بإزالة الشريحة بقلب الماوس المركب من الفريزر وضعها في مجفف حتى تجف. قم بتشغيل HTX M3 + Sprayer. افتح تطبيق HTX على الكمبيوتر المحمول ، وفي الطريقة ، اضبط درجة حرارة الفوهة على 75 درجة مئوية ، ومعدل التدفق على 100 ميكرولتر في الدقيقة ، والضغط على 10 رطل لكل بوصة مربعة.

سجل اسم العينة والقطبية والمصفوفة والمذيب والتركيز في دفتر المختبر. ثم احسب كمية المصفوفة المطلوبة للتركيز المطلوب. بعد ذلك ، قم بوزن الكمية المطلوبة من 2 ، 5-حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك لمصفوفة الوضع الموجب.

قم بإذابة المصفوفة في 70٪ من الميثانول في أنبوب سعة 15 ملليلترا. Sonicate محلول المصفوفة لمدة 10 دقائق. أثناء الصوتنة ، قم بإزالة الشريحة من المجفف.

افتح صينية البخاخ. ثم ضع الشريحة في الزاوية اليسرى السفلية وقم بلصق الحواف. حدد منطقة رش العينة وأغلق الدرج.

باستخدام حقنة وفلتر ، ارسم محلول المصفوفة في المحقنة. قم بتصفية محلول المصفوفة من خلال المحقنة في القارورة مع الغطاء الأسود الموجود على الجانب الأيسر من البخاخ. ضع القارورة مرة أخرى في مكانها المخصص على البخاخ وأدخل أنبوب الخط D بإحكام في القارورة.

بعد ذلك ، قم بتشغيل الغاز الخامل وتأكد من أن المقياس الموجود على البخاخ يقرأ 10 رطل لكل بوصة مربعة. اضغط على ابدأ ، وبمجرد أن يصل البخاخ إلى درجة الحرارة المحددة ، حدد زر البدء الوامض لبدء الرش. بعد اكتمال الرش ، قم بإزالة العينة من البخاخ وضعها في حامل الشريحة MALDI.

امسح حامل الشرائح MALDI ضوئيا وانزلقه باستخدام ماسح ضوئي. احفظ الصورة على محرك أقراص محمول لاستخدامها مع تصوير قياس الطيف الكتلي. حدد خيار الغسيل على البخاخ وحرك الخط D من قارورة المصفوفة إلى دورق النفايات.

أخيرا ، رش الميثانول على صينية البخاخ وامسحها نظيفة. أطفئ النيتروجين. حدد تصوير قياس الطيف الكتلي MALDI لأنسجة عضلة القلب الاحتشاء كتلة الأيونات الجزيئية لشحن 577.52 ، والتي من المحتمل أن تكون مطابقة ل COHb في C أو D ، مما يشير إلى المشاركة في إعادة تشكيل عضلة القلب.

أظهرت صورة الموجات فوق الصوتية رباعية الأبعاد مناطق عضلة القلب بأقل من 20٪ من مساحة السطح متوترة ، والتي تم تصويرها على أنها أنسجة خضراء صفراء ، مما يشير إلى مناطق الاحتشاء. في عرض المحور الطويل لأنسجة احتشاء عضلة القلب ، كان تغيير موقع الدهون مرئيا ، مما أدى إلى تعقيد العلاقة بين الميكانيكا الحيوية للأنسجة والتركيب الجزيئي.