تحليل تدفق الخلايا لتعبير عوامل الأنسجة في الصفائح الدموية البشرية

في هذا البروتوكول ، نقترح برنامجا تعليميا خطوة بخطوة لقياس عامل الأنسجة المرتبطة بالصفائح الدموية عن طريق قياس تدفق الدم الكامل ، وتقييم البروتين في الحيز داخل الخلايا ، وظروف الاعتقال وعلى سطح الخلية ، سواء في حالة الراحة أو عند التنشيط مع DP ، يتم التعبير عن أحد أكثر عوامل الأنسجة الناهضة للصفائح الدموية شيوعا بواسطة مجموعة فرعية من الصفائح الدموية. إذا تم قياس الصفائح الدموية الموجبة لعامل الأنسجة في البلازما الغنية بالصفائح الدموية الغنية بالصفائح الدموية ، أو في الصفائح الدموية المغسولة ، فقد تفقد هذه المجموعة الفرعية أثناء تحضير العينة. لا يحدث هذا الخطر عند إجراء هذا التقييم في الحائط.

كان عامل الأنسجة المرتبطة بصفائح الدم مثيرا للجدل منذ التقرير الأول الذي نشر في بداية القرن بسبب مشكلات ما قبل التحليل والمنهجية. يلقي هذا البروتوكول الضوء على هذه القضايا ويستخدم أيضا لإجراء مشروع دولي تدعمه الجمعية الدولية للتخثر والإرقاء ISDH لتوحيد قياس عامل الأنسجة المرتبط بالصفائح الدموية أو قياس تدفق الدم على بضعة ميكرولترات من الدم ، مما يسمح بتحليل عامل الأنسجة المرتبطة بالصفائح الدموية المناسب في البيئة السريرية. علاوة على ذلك ، فإن إمكانية إصلاح العينة ووضع العلامات بعد ذلك ، تجعل هذا التحليل ممكنا للعديد من المستشفيات والمختبرات.

للبدء ، قم بإعداد أنبوب اختبار واحد لكل حجم جسم مضاد. للاختبار ، أضف قطرة واحدة من الخرز السلبي وقطرة واحدة من الخرز الموجب إلى كل أنبوب اختبار. أضف 20 ميكرولترا من كل تخفيف للأجسام المضادة إلى أنبوب الاختبار والدوامة.

احتضان أنابيب الاختبار على الفور في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم أضف ملليلترا واحدا من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم الرقم الهيدروجيني 7.4 إلى كل أنبوب ودوامة ، وقم بقلب فراغ سترات الصوديوم برفق خمس مرات لخلط الدم ومضادات التخثر جيدا. انقل 50 ميكرولترا من الدم إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

ثم أضف 950 ميكرولتر من 1٪ ألدهيد بارافورم. اخلطي العينة برفق وحتضنيها لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن قم بالطرد المركزي للعينة عند 1،500 جم لمدة خمس دقائق مع استراحة في درجة حرارة الغرفة.

بعد إزالة المادة الطافية ريس ، قم بتعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. عند الرقم الهيدروجيني 7.4 ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من الدم الثابت في كل أنبوب وقم بطردها عند 1،500 جم لمدة خمس دقائق. مع كسر في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة الريسوس الطافي.

قم بتعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من 0.1٪ Triton PBS لاختراق العينات واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. للبدء ، قم بإعداد أنبوب واحد للتألق ناقص عنصر تحكم واحد وأنبوب واحد لتلوين عامل الأنسجة. أضف الأجسام المضادة إلى 100 ميكرولتر من الدم الكامل الثابت والنفاذي في كل أنبوب.

أضف 300 ميكرولتر من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم عند درجة الحموضة 7.4 لكل أنبوب واخلطه. ثم قم بتخزين العينات الملطخة في الظلام حتى يخفف تحليل قياس التدفق الخلوي ألفا CD 1 42 HTF الجسم المضاد أحادي النسيلة واحد ، و Alexa Fluer 6 33 الغلوبولين المناعي المضاد للفأر G في PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. بعد ذلك ، قم بإعداد ثلاثة أنابيب عينة وتوزيع PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.

عند الرقم الهيدروجيني 7.4 ، قم بتوزيع 7.5 ميكرولتر من ألفا CD المخفف 1 42 htf الجسم المضاد أحادي النسيلة ، وأضف خمسة ميكرولترات من ثنائي فوسفات الأدينوزين. اقلب مكنسة السترات برفق خمس مرات لخلط الدم ومضادات التخثر جيدا. قم بتوزيع خمسة ميكرولترات من الدم الكامل في كل أنبوب.

اخلطي العينات برفق واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتثبيت العينة ، أضف 300 ميكرولتر من 1٪ PFA إلى كل أنبوب وجهاز طرد مركزي عند 1 ، 500 جم لمدة خمس دقائق مع كسر في درجة حرارة الغرفة. بمجرد إزالة المادة الطافية ، قم بتعليق الحبيبات في 90 ميكرولتر من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.

عند درجة الحموضة 7.4 عن طريق الماصة برفق ، قم بتوزيع خمسة ميكرولترات من Alexa Fluer المخفف 6 و 33 Immunoglobulin G وخمسة ميكرولترات من alpha CD 41 PE في كل أنبوب. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 300 ميكرولتر من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم عند درجة الحموضة 7.4 إلى كل أنبوب واخلطه.

للبدء ، قم بإنشاء منطقة مبعثر أمامية ومخطط نقطة منطقة مبعثر جانبية على مقياس لوغاريتمي يعرض جميع الأحداث ، وقم بإنشاء مخطط نقطة CD 61 A ومنطقة مبعثرة جانبية على مقياس لوغاريتمي يعرض جميع الأحداث. لتصور عدد الصفائح الدموية ، اضبط العتبة على حوالي 2000 على ارتفاع التشتت الجانبي و 1000 على لكل CP B ستة 90 H. اضبط PE Y 5 8 5 ولكل CP B ستة 90 كسبا وفقا لمراقبة الجودة اليومية واضبط معدل التدفق على منخفض. الآن ارسم منطقة بين 10 أشعة أس ثلاثة و 10 أشعة أس خمسة تسمى CD 61 موجبا.

لتحديد عدد الصفائح الدموية ، قم بتكرار FMO وإعادة تسميته TFIC. الحصول على العينات وتسجيل ملف بيانات من 10,000 حدث داخل البوابة الإيجابية CD 61. قم بإنشاء منطقة مبعثرة أمامية ومخطط نقطة لمنطقة مبعثرة جانبية على مقياس لوغاريتمي يعرض جميع الأحداث.

قم بإنشاء مخطط نقطة لمنطقة مبعثر CD 41 A على مقياس لوغاريتمي يعرض جميع الأحداث. ثم اضبط اكتساب Alexa floor 6 33 وكسب PE wifi 5 8 5 وفقا لمراقبة الجودة اليومية. اضبط العتبة تقريبا على 1000 على ارتفاع التشتت الجانبي وإلى 2 ، 500 على PEY 5 85 H.To تصور عدد الصفائح الدموية ، اضبط معدل التدفق على منخفض.

الآن ارسم منطقة بين 10 أشعة أس أربعة و 10 مرفوعة إلى قوة خمسة تسمى CD 41 موجبة لتحديد مجموعة الصفائح الدموية. ثم قم بإنشاء أنبوب لكل عينة وقم بتسمية TF Unstimulated و TF Stimulated. الحصول على العينات وتسجيل ملف بيانات من 10,000 حدث داخل جهاز الطرد المركزي المشي الإيجابي CD 41.

مكنسة سترات الصوديوم 0.129 مولار عند 100 جم لمدة 10 دقائق دون انقطاع في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة المكنسة الكهربائية من جهاز الطرد المركزي. اجمع البلازما الغنية بالصفائح الدموية التي تم الحصول عليها ، وانقلها إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 10 مل وسجل حجم عدد الصفائح الدموية التي تم جمعها مرتين في البلازما الغنية بالصفائح الدموية باستخدام عداد خلايا الدم.

أظهر تجمع الصفائح الدموية الذي تم تحديده بواسطة تلطيخ الأجسام المضادة alpha CD 61 أن ما يقرب من 26.8٪ من الصفائح الدموية المنتشرة تحتوي على تحليل التدفق الخلوي لعامل الأنسجة داخل الخلايا أشار إلى أن عامل الأنسجة يتم التعبير عنه بحوالي 2.8٪ من الصفائح الدموية أثناء الراحة ويزداد إلى 24.5٪ عند التنشيط مع ثنائي فوسفات الأدينوزين. تبين أن الصفائح الدموية ذات الحجم الأكبر تعبر عن مستويات أعلى من عامل الأنسجة مع النقاط الخضراء التي تمثل المجموعة الفرعية الأكبر للصفائح الدموية. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن البلازما الغنية بالصفائح الدموية المحضرة باستخدام الطرد المركزي 100 جم حافظت على مجموعة مماثلة للدم الكامل ، وتحتفظ بالصفائح الدموية ذات الحجم الأكبر مع إيجابية أعلى لعامل الأنسجة.

أدت قوة الطرد المركزي الأعلى إلى فقدان الصفائح الدموية الإيجابية لعامل الأنسجة الأكبر كما يتضح من انخفاض التشتت الأمامي في مجموعة البلازما الغنية بالصفائح الدموية.