نموذج فأر للتحول النزفي الناجم عن ارتفاع السكر في الدم الحاد جنبا إلى جنب مع نقص التروية البؤري العابر

في البحث الحالي ، نهدف إلى توفير بروتوكول شامل ومفصل لإنشاء نموذج حيواني قابل للتكرار بدرجة عالية للتحول الجذري البشري باستخدام إعادة تروية انسداد الشريان الدماغي الأوسط في الفئران C57BL / 6 المصابة بارتفاع السكر في الدم الحاد.

بالمقارنة مع التقنيات الأخرى ، يوضح بروتوكولنا قابلية تكرار جيدة ، وثبات عال ، وانخفاض معدل وفيات ، مما يجعله مناسبا للاستخدام على نطاق واسع في الأبحاث قبل السريرية للتحول النزفي.

في المستقبل ، سيكون تركيزنا على التحقيق في تأثير التحول النزفي على علم الأعصاب واستكشاف الآلية الأساسية.

[مدرب] للبدء ، امسح المنصة الجراحية ومنطقة العمل المحيطة بها بنسبة 75٪ من الإيثانول. قم بتشغيل مفتاح التسخين واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. حرك الفأر المخدر على المنصة الجراحية في وضع ضعيف وقم بتأمين أطرافه باستخدام شريط لاصق. بعد ذلك ، قبل 15 دقيقة من الإجراء الجراحي ، قم بإعطاء 30٪ جلوكوز أو محلول ملحي طبيعي للفئران داخل الصفاق. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق أفقي بفتحة 1.5 سم على طول خط الوسط للرقبة. قم بإجراء تشريح حاد داخل منطقة المثلث المقلوب لتحديد وفصل الشريان السباتي المشترك الأيسر. باستخدام ملقط العين، قم بتشريح العصب المبهم المجاور للشريان السباتي المشترك والأنسجة المخاطية المحيطة بالأوعية الدموية. باستخدام خياطة قابلة للامتصاص بحمض البولي جليكوليك 5-0 ، قم بعمل جرس على الشريان السباتي المشترك ، مع الحفاظ على الخيط غير متوتر. ثم افصل لأعلى على طول الشريان السباتي المشترك. الآن ، افصل التشعب لفضح الشريان السباتي الخارجي والداخلي بالكامل. قم بلف وربط خياطة قابلة للامتصاص 5-0 بحمض البولي جليكوليك حول الشريان السباتي الخارجي بعيدا عن التشعب. بعد ذلك ، باستخدام اثنين من مشابك الشريان الشرياني الصغير الخفيف ، قم بتثبيت كل من الشريان السباتي المشترك والشريان السباتي الداخلي مؤقتا لمنع تدفق الدم. بعد ذلك ، قم بتمديد ربطة الخيط على الشريان السباتي الخارجي البعيد والشريان السباتي المشترك لتقويم جزء الشريان السباتي الخارجي. الآن ، استخدم مقصا صغيرا لعمل شق صغير بين ربطتي الخياطة على الشريان السباتي الخارجي. أدخل خياطة أحادية الشعيرات المطلية بالسيليكون بطول 30 ملم في الشريان السباتي الخارجي. قم بلف وربط خياطة ثانية قابلة للامتصاص بحمض البولي جليكوليك 5-0 على الشريان السباتي الخارجي بالقرب من التشعب لمنع خياطة الشعيرات الأحادية من التراجع. بعد ذلك ، قم بقطع الشريان السباتي الخارجي تماما إلى الربط الدائم ، وقم بإزالة ملقط الشريان المشبك من الشريان السباتي الداخلي. بعد ذلك ، اسحب الخيط إلى تشعب الشريان السباتي المشترك. اسحب جذع الشريان السباتي الخارجي وقم بتدويره بعناية. اضبط اتجاه الخيط وأدخله على بعد 9 إلى 10 ملليمترات من تشعب الشريان السباتي المشترك في الشريان السباتي الداخلي لسد الشريان الدماغي الأوسط. بعد ذلك ، شد الخيط الثاني القابل للامتصاص بحمض البولي جليكوليك حول الشريان السباتي الخارجي وإزالة مشبك الشريان من الشريان السباتي المشترك. بعد إعادة تخدير الفأر ، باستخدام مشبك الشريان المجهري ، قم بتثبيت الشريان السباتي المشترك. اسحب الشعيرات الأحادية جزئيا من الشريان السباتي الداخلي حتى يصبح الطرف المطلي بالسيليكون مرئيا من خلال الشريان السباتي الداخلي. بعد ذلك ، ضع مشبك شريان صغير آخر على الشريان السباتي الداخلي فوق الطرف المطلي بالسيليكون. اسحب الشعيرات الأحادية تماما وقم بإحكام بتفويض جذع الشريان السباتي الخارجي. أخيرا ، قم بإزالة مشبك الشريان المجهري من الشريان السباتي الداخلي والشريان السباتي المشترك على التوالي. للبدء ، امسح ذيل الفأر بكرة قطنية مبللة بالكحول لجعل وريد الذيل مفرط الدم تماما. باستخدام مقص جراحي ، اقطع طرف الذيل بمقدار ملليمتر إلى ملليمترين. اضغط برفق على طول جذر الذيل إلى الحافة لتسهيل تدفق الدم من الشق. بعد ذلك ، ضع خزان امتصاص العينة لورقة الاختبار على حافة قطرة الدم. اقرأ قراءة جهاز قياس نسبة السكر في الدم وسجل النتيجة. لقياس تدفق الدم الدماغي ، أمسك طرف مسبار قياس التدفق بالليزر دوبلر بشكل عمودي على سطح الجمجمة الجدارية اليسرى حتى تتم قراءة تدفق مستقر ، وسجل هذه القيمة. بعد إزالة دماغ فأر MCAO القتل الرحيم ، ضع أنسجة المخ في مصفوفة دماغ القوارض وقم بتقطيعها إلى شرائح إكليلية بحجم ملليمترين. انقل الشرائح إلى طبق 24 بئرا واحتضانها بمحلول كلوريد 2،3،5-Triphenyltetrazolium بنسبة 2٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بقص أقسام الأنسجة من اللوحة المكونة من 24 بئرا باستخدام ملقط منحني ورتبها على لوحة المسح الزجاجي. تلطخ شريحة الدماغ الثابتة بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة ثلاث دقائق. قم بتمييزها عن طريق غمر الشريحة في كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 5٪ لمدة خمس ثوان. ثم قم بتجفيف الشريحة وهيالين بها باستخدام محاليل الإيثانول المتدرجة والزيلين. قم بتركيب القسم براتنجات محايدة. بعد 23 ساعة من MCAO ، قم بحقن محلول إيفانز الأزرق بنسبة 2٪ في الفأر وحصاد الدماغ. بعد تجانس الأنسجة وطرد مركزيها ، انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي آخر وقم بتخفيفه أربعة أضعاف بالإيثانول. قم بقياس امتصاص السائل الطافي عند 620 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. حقن FITC-dexterrn في وريد الذيل بعد 24 ساعة من MCAO واتركه يدور في الدم لمدة 10 دقائق. بعد تثبيت أنسجة المخ ، قم بتضمين أنسجة المخ باستخدام مركب درجة حرارة القطع الأمثل وقم بتقطيعه إلى أقسام بسمك 30 ميكرومتر. انقل الأقسام إلى شريحة مجهرية باستخدام حلقة تلقيح ، مع التأكد من أنها تلتصق بسطح الشريحة. قم بتركيب أقسام أنسجة المخ باستخدام وسيط تركيب يحتوي على 4 ',6-diamidino-2-phenylindole. زادت مستويات الجلوكوز في الدم بشكل ملحوظ بعد MCAO في الفئران المحقونة بالجلوكوز مقارنة بالمجموعات المالحة. لم يلاحظ احتشاء مرئي على شرائح الدماغ في الوسام مع المحلول الملحي أو الوهم مع مجموعة الجلوكوز. أظهرت MCAO مع مجموعة الجلوكوز حجما أكبر بكثير من احتشاء دماغي مقارنة ب MCAO مع مجموعة المياه المالحة. لوحظت نزيف ثقبي متعدد في نصف الكرة الإقفارية من MCAO مع مجموعة الجلوكوز ، والتي كانت غائبة في المجموعات الأخرى. لوحظ تسلل كبير لخلايا الدم في مناطق احتشاء القشرة والمخطط في MCAO مع مجموعة الجلوكوز. كانت نفاذية إيفانز بلو وتسرب FITC-dextaren أعلى بشكل ملحوظ في MCAO مع مجموعة الجلوكوز مقارنة ب MCAO مع مجموعة المياه المالحة.