اختبار الغزو المشترك للبلاعم والورم الكروي

نريد التحقيق في تفاعل الخلايا السرطانية والمناعية لفهم كيفية تفاعلها أثناء ورم خبيثات بشكل أفضل. في معظم الحالات ، تكون النماذج في الجسم الحي هي الطريقة الروتينية لمتابعة الأسئلة البحثية المتعلقة بالغزو ثلاثي الأبعاد للخلايا السرطانية في سياق الجهاز المناعي ، أو يتم التركيز على المكونات المعزولة للنظام. طريقة تسمح بتحليل السلوك الخلوي الذي يحاكي تعقيد الوضع في الجسم الحي ، ولكنه يسمح بالتلاعب المباشر بشكل مباشر بالخصائص البيئية المحددة تحت المجهر.

نوضح أن الخلايا السرطانية غير المعدلة ستقلل من الغزو في مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد I عندما يتم زراعتها بشكل مشترك مع البلاعم التي تم استنفادها للبروتين الحركي KIF16B. يشير هذا إلى دور إعادة التدوير المدفوعة ب KIF16B لبروتينات سطح البلاعم في البيئة المكروية للورم. نود أن نستمر في تحسين طريقتنا بطريقة تسمح بتصور تدهور المصفوفة في واجهة سياق الخلايا السرطانية للبلاعم ، وبالتالي الحصول على فهم أفضل للآليات المتدهورة واللاصقة.

للبدء ، قم بزراعة خلايا H1299 GFP بوسط خلية سرطانية في قارورة زراعة خلية مساحتها 25 سم مربع عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون حتى تصل إلى 80٪ التقاء. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام DPBS وأضف ملليلتر واحد من Trypsin-EDTA لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تنفصل الخلايا. أوقف التفاعل الأنزيمي عن طريق إضافة ملليلترين من وسائط الخلايا السرطانية.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية المنفصلة في أنبوب سعة 15 مليلتر عند 245 جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على محلول التربسين قبل غسل الحبيبات بخمسة ملليلتر من DPBS. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط الخلايا السرطانية.

عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور. انقل 8,000 خلية إلى صفيحة التصاق منخفضة للغاية 96 بئرا في حجم نهائي يبلغ 25 ميكرولتر من وسط الخلايا السرطانية. احتضان الخلايا لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد ثلاثة أيام ، افحص الكرويات تحت المجهر للتأكد من التوحيد. بعد جمع عينة الدم البشري ، انقل 20 مل من الدم من كيس نقل الدم إلى أنبوب تفاعل سعة 50 ملليلترا. أضف 15 مل من وسط فصل الخلايا الليمفاوية في أنبوب جديد سعة 50 مل.

انقل 20 مل من الدم بعناية إلى أنبوب فصل الخلايا الليمفاوية المحتوي على وسط دون خلط ، وقم بالطرد المركزي للخليط عند 450 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أثناء الطرد المركزي ، أضف 10 ملليلتر من RPMI 1640 المتوسط البارد في أنبوب جديد سعة 50 ملليلترا. بعد الطرد المركزي ، انقل المرحلة البيضاء الكثيفة من الأنبوب المحتوي على الدم إلى الأنبوب المحتوي على RPMI المحضر ، واملأه حتى 50 مل ب RPMI البارد.

بالطرد المركزي للتعليق عند 450 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من RPMI البارد واملأها حتى 50 مل باستخدام RPMI 1640. الطرد المركزي المزيج مرة أخرى ، وأعد تعليق الحبيبات في 50 مل من RPMI.

مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للعينة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1.5 مل من المخزن المؤقت للخلايا الأحادية الباردة. بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من MicroBeads المضادة ل CD14 في تعليق الخلية ، واحتضن لمدة 15 دقيقة على الجليد. أثناء الحضانة ، قم بإعداد عمود فصل عن طريق توصيل مرشح برف فاصل مغناطيسي.

أضف 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت أحادي الخلية إلى العمود للتوازن. بعد الحضانة ، اسكب معلق الخلية على الفلتر واتركه يتدفق بالجاذبية إلى أنبوب النفايات. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت أحادي الخلية لغسل العمود الذي يحتوي على الخلايا المرتبطة بالخرز المغناطيسي.

استبدل أنبوب النفايات الموجود أسفل العمود بأنبوب جديد سعة 50 مليلتر يحتوي على 20 مل من RPMI. أضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت أحادي الخلية إلى العمود. قم بإزالة العمود من الرف المغناطيسي وإرفاق الختم.

اضغط على الخلايا في الأنبوب المحضر سعة 50 مليلتر واملأه حتى 30 مل ب RPMI. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نيوباور تحت المجهر الضوئي ، واضبط عدد الخلية إلى مرتين في 10 إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر باستخدام RPMI. قم بزرع مليلتر واحد من معلق الخلية في كل بئر من غرفة من ستة آبار ، واحتضن لمدة ساعتين إلى أربع ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد الحضانة ، تحقق مما إذا كانت الخلايا ملتصقة بشكل صحيح واستبدل RPMI ب 1.5 مل من أحادي الوسط. استمر في الحضانة لمدة تصل إلى ستة أيام حتى تتمايز الخلايا الوحيدة إلى ضامة. بعد اشتقاق البلاعم البشرية الأولية من عينات دم المتبرع بها في طبق من ستة آبار ، أضف 500 ميكرولتر من Accutase ، واحتضن لمدة 40 دقيقة لفصل البلاعم.

ثم أضف 500 ميكرولتر من الوسط وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر للطرد المركزي. ثم اغسل الخلايا مرة واحدة بملليلترين من DPBS واعدها بغرفة Neubauer. قم بتخفيف العدد المطلوب من البلاعم في 40 ميكرولترا من الكولاجين الذي أخلطه ، وقم بدوامة الأنبوب لفترة وجيزة.

لغسل الكرويات ، أضف 300 ميكرولتر من DPBS في آبار صفيحة 96 بئرا. استخدم طرف ماصة زرقاء سعة مليلتر واحد مع نهاية مقطوعة لجمع الستيرويد باستخدام DPBS. بمجرد أن يستقر الستيرويد في الحافة, دفع الماصة لفترة وجيزة إلى أسفل غرفة التصوير لنقل الستيرويد الورم عن طريق التوتر السطحي.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من DPBS المتبقية المنقولة مع الستيرويد. أضف بسرعة 40 ميكرولترا من مزيج البلاعم الكولاجين الأول إلى غرفة التصوير التي تحتوي على الستيرويد. احتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في ظروف رطبة لبلمرة مزيج الكولاجين بالكامل.

بعد البلمرة ، أضف بعناية 25 ميكرولترا من وسائط الخلايا السرطانية إلى كل بئر ، واستمر في الحضانة لمدة ثلاثة أيام. صور العينة الحية باستخدام مجهر المسح بالليزر في النقاط الزمنية المطلوبة. تم قياس المساحة الكروية H1299 GFP لتكون 40،307 ميكرومتر مربع في اليوم الثالث من الغزو ، بينما وجد أن المحيط الكروي يبلغ 1700.17 ميكرومتر ، مما يشير إلى النمو بمرور الوقت.

لوحظ غزو جماعي للخلايا السرطانية من الكروية. تم تحديد 51 جسيما معزولا ، بمثابة مؤشر لغزو الخلايا السرطانية الفردية. حافظ الكروي على نسبة عرض إلى ارتفاع تبلغ 1.10 ، ودائرية قدرها 0.18 ، مما يدل على تشوه منخفض.