تلطيخ حي / ميت لقياس الخلايا القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة في البكتيريا المسببة للجروح المعالجة بعسل مانوكا

يهدف هذا المشروع البحثي إلى التحقيق في تأثير عسل مانوكا على فسيولوجيا البكتيريا. قدمت الدراسات الحديثة مزيدا من الأفكار حول التأثيرات المضادة للميكروبات لعسل مانوكا على فسيولوجيا البكتيريا. تشير النتائج الأولية التي توصلنا إليها إلى أن بكتيريا عسل مانوكا تدخل حالة السكون المقاومة للمضادات الحيوية والقابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة ، ولكن بدرجة أقل من تلك المعالجة بالمضادات الحيوية التقليدية.

بناء على تجاربنا ، سيكون من المثير للاهتمام مقارنة ملامح التعبير عن عسل مانوكا و VBNCs التقليدية التي يسببها المضادات الحيوية. للبدء ، خذ القوارير التي تحتوي على سلالات بكتيرية مجمدة. افتح كل واحدة بالتتابع واستخدم عصا معقمة لكشط كمية صغيرة من البكتيريا المجمدة على لوحة Luria-Bertani أو LB أجار المسمى بشكل مناسب.

استبدل غطاء القارورة وضعه بسرعة في الفريزر. احتضان المزارع البكتيرية لمدة 18 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، استخدم ماصة مصلية لنقل ملليلترين من مرق LB إلى أنبوبي اختبار معقمين.

تعقيم حلقة التلقيح في لهب موقد بنسن. ثم انقل ربع حلقة من البكتيريا من صفيحة أجار LB إلى أنبوب الاختبار المسمى بشكل مناسب والذي يحتوي على مرق LB. احتضان أنبوب الاختبار في ظل الظروف الهوائية في حاضنة اهتزاز عند حوالي 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة.

لإعداد عسل مانوكا وعلاجات البكتيريا بالمضادات الحيوية ، أضف 10 ميكرولترات من الثقافة البكتيرية إلى 10 ملليلتر من مرق مولر هينتون للحصول على تخفيف 1: 1 ، 000 للثقافة البكتيرية ، والتي تحتوي على ما يقرب من 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة السادسة لكل مليلتر. استخدم المزارع المخففة لإعداد ثلاث عينات لكل نوع من أنواع البكتيريا ، وعنصر تحكم غير معالج ، وعينة معالجة بعسل مانوكا ، وعينة معالجة بالمضادات الحيوية. أضف عسل مانوكا والمضاد الحيوي إلى الأنابيب المناسبة.

انقل 0.1 مليلتر و 0.5 مل من العينة غير المعالجة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة لعدد الألواح القابلة للحياة والتلوين الحي / الميت ل T يساوي صفرا عينات. ثم احتضان العينات غير المعالجة وعسل مانوكا المعالج بالمضادات الحيوية في ظروف هوائية عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز بسرعة 250 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. قم بإعداد تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف من T يساوي صفرا عينة غير معالجة في مرق LB للحصول على عدد قابل للعد من الخلايا لعدد الألواح القابلة للحياة.

انشر 50 ميكرولترا من كل عينة مخففة على نصف صفيحة أجار LB. احتضان ألواح الأجار في ظل الظروف الهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة ألواح أجار LB من الحاضنة.

حدد صفيحة التخفيف التي تحتوي على ما يقرب من 25 إلى 150 مستعمرة واحسب العدد الدقيق للمستعمرات. استخدم صيغة وحدة تشكيل المستعمرة لتحديد عدد الخلايا القابلة للزراعة لكل مليلتر. في اليوم الثالث ، أضف 0.5 مل من 0.85٪ كلوريد الصوديوم إلى 0.5 مل من T يساوي صفرا عينة تحكم في التلوين الحي / الميت غير المعالج.

امزج 1.5 ميكرولتر من SYTO 9 و 1.5 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم لكل عينة. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من الخليط إلى كل عينة. احتضان العينات عند 21 درجة مئوية في الظلام لمدة 15 دقيقة.

انقل ستة ميكرولترات من العينة الملطخة والمخلوطة برفق إلى مقياس كثافة الدم القابل للتصرف وعرضها تحت مجهر الفلورسنت باستخدام مرشح إيزوثيوسيانات الفلورسين أو FITC وعدسة موضوعية 40X. التقط صورة توضح كلا من خطوط شبكة مقياس كثافة الدم والخلايا الخضراء. عد الخلايا الخضراء في ستة حقول لكل عينة، مع ملاحظة أبعاد الشبكة لحساب عدد الخلايا الخضراء لكل وحدة تخزين.

أخيرا ، احسب عدد الخلايا القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة عن طريق طرح عدد الخلايا القابلة للزراعة لكل مليلتر تم الحصول عليها باستخدام عدد الألواح القابلة للحياة من عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مليلتر تم الحصول عليها باستخدام التلوين الحي / الميت. في اليوم الرابع ، بعد إزالة المزارع البكتيرية غير المعالجة وعسل مانوكا المعالجة بالمضادات الحيوية من الحاضنة ، تجمع 0.1 مل و 0.5 مل من كل عينة في أنابيب طرد مركزي دقيقة لعدد الألواح القابلة للحياة والتلوين الحي / الميت. يوضح هذا الشكل عدد الخلايا القابلة للزراعة والقابلة للحياة التي تم تحديدها باستخدام عدد الألواح القابلة للحياة والتلوين الحي / الميت لثقافات S.aureus و P.aeruginosa.

تظهر النتائج أن عدد الخلايا القابلة للحياة والقابلة للزراعة التي تم اكتشافها في الثقافات غير المعالجة وعسل مانوكا لم يكن مختلفا بشكل كبير. كانت مزارع المكورات العنقودية الذهبية المعالجة بالتوبرامايسين تحتوي على خلايا قابلة للزراعة أقل من الخلايا القابلة للحياة ، لكن هذا الاختلاف لم يكن كبيرا. فقط ميروبينيم المعالج P.aeruginosa أظهر انخفاضا ذا دلالة إحصائية في الخلايا القابلة للزراعة مقارنة بالخلايا القابلة للحياة.