التصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الأبهرية في تصلب الشرايين

هنا ، نقدم بروتوكولات محسنة لإزالة الأنسجة لتصوير الشريان الأورطي الفأري في ثلاثة أبعاد (3D). نحدد أحدث الإجراءات للتلوين المناعي والتطهير البصري والتصوير بقصد تحديد القرب التشريحي للجهاز العصبي المحيطي مع لويحات تصلب الشرايين والعرض التراكمي في تصلب الشرايين.

يركز بحثنا على فهم دور الجهاز العصبي في تطور تصلب الشرايين. على وجه التحديد ، كل تفاعل مع التلال ، نهدف إلى الإجابة عن كيفية تغير العصب أثناء تصلب الشرايين وكيف يؤثر تفاعله على تطور المرض. تستخدم حاليا العديد من التقنيات المتطورة للنهوض بأبحاث تصلب الشرايين لتحسين فهم آليات المرض.

ويشمل ذلك إزالة الأنسجة والتصوير ثلاثي الأبعاد ، والتقنيات المجهرية المتقدمة ، والذكاء الاصطناعي ، وتسلسل الخلية المفردة ، والتعلم الآلي. أثناء تطور تصلب الشرايين ، تخضع مكونات جدار الشرايين لإعادة هيكلة قوية. يعد تحديد التغييرات في التصوير ثلاثي الأبعاد والتصوير عالي الدقة للأنسجة السليمة من التحديات التجريبية الرئيسية.

ستساعد أدوات التصوير الموضحة هنا الباحثين وأطباء القلب على فهم المرض بشكل أفضل والمساعدة في علاج المرضى في النهاية. يوفر البروتوكول الموصوف هنا العديد من المزايا مقارنة بالتقنيات التقليدية مثل تصوير الأنسجة العميقة للأنسجة السليمة ، بالإضافة إلى تصور هيكلها الذي يتعذر الوصول إليه. ستساعد هذه البروتوكولات على فهم تفاعل الخلية والخلية والأنسجة بشكل أفضل لتحسين فهم تطور المرض.

يمكن أن يوفر تصور التغيرات الخلوية والهيكلية في 3D في الأنسجة السليمة نظرة ثاقبة جديدة لفهم الأسئلة البيولوجية التي لم تتم الإجابة عليها في أبحاث القلب والأوعية الدموية بشكل أفضل. للبدء ، ضع الفأر المخدر على صفيحة رغوية مغطاة بمناشف ورقية جراحية. ثبت ذراعي وساقي الفأر في وضع ضعيف باستخدام أشرطة لاصقة.

تطهير الصدر ب 75٪ من الإيثانول. اجمع الدم من البطين الأيسر باستخدام حقنة يمكن التخلص منها سعة مليلتر واحد. ثم قم بعمل شق خط الوسط على الصدر وشق صغير في الأذين الأيمن.

قم بدمج البطين الأيسر للفأر ب 10 ملليلتر من خمسة ملليمولات EDTA في PBS لمدة خمس دقائق حتى يتم التخلص من الدم ، متبوعا ب 20 مل من PBS لمدة 5 إلى 10 دقائق. أخيرا ، قم بتعبئة 10 مل من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة. تحت مجهر ستيريو تشريح ، قم بإزالة الأعضاء الداخلية ، بما في ذلك الجهاز الهضمي والأعضاء التناسلية.

اترك القلب الشريان الأورطي والكلى سليمين. ثم قم بإزالة الغدة الصعترية والأنسجة الدهنية المحيطة بعناية. كشف الشريان الأورطي بأكمله من الشريان الأورطي الصاعد إلى التشعب الحرقفي.

احصد الشريان الأورطي بالكامل وضعه في طبق بتري مليء ب PBS. افصل الشريان الأورطي إلى أجزاء مختلفة وقسمه طوليا لاثنين من 2 أو 2'Thiodiethanol أو TDE للتصهير. قم بتثبيت الشريان الأورطي النهائي على صفيحة شمع سوداء مسطحة على شكل Y ، وثبته في 4٪ بارافورمالدهيد طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بفك الشريان الأورطي وانقله إلى PBS لغسلها لمدة خمس دقائق. ثم انقل الشريان الأورطي إلى محلول حجب لمدة ساعتين للانسداد والنفاذ. بعد ذلك ، احتضان الشريان الأورطي بالأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب لمدة 24 ساعة.

اغسل الشريان الأورطي في PBS لمدة خمس دقائق ، وكرر خمس مرات قبل احتضانه بالأجسام المضادة الثانوية في مصل الحمار العادي بنسبة 10٪ و DAPI للتلوين النووي طوال الليل ، انقل الشريان الأورطي الملطخ إلى تركيز متزايد من محلول TDE. بعد ذلك ، قم بلصق فاصل التصوير المستطيل اللزج على الوجهين جيدا بشريحة زجاجية نظيفة وانقل الشريان الأورطي الذي تم تطهيره ، مما يضمن أن الوجه النهائي يواجه زلاجة الغطاء. قم بتركيب الشريان الأورطي بقطرات من محلول TDE بنسبة 60٪ وقم بتوصيل زلة غطاء بعناية بالبئر لتجنب فقاعات الهواء.

قم بتشغيل مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر المقلوب المزود بهدف غمر الزيت 20x. قم بضبط كاشفات الصمام الثنائي الهجين بناء على أصباغ البقع. اضبط إعدادات العرض وحدد تنسيق XY 1024 × 1024 بكسل للتصوير.

قم بإسقاط زيت الغاطس على زلة الغطاء وحرك الهدف 63x بشكل خشن نحو العينة حتى يلامس زيت الغمر وانزلاق الغطاء. ثم حدد منطقة الاهتمام واحصل على مكدسات Z من جانب adventitia من الشريان الأورطي للوجه النهائي بحجم خطوة من اثنين إلى أربعة ميكرومتر حتى عمق 60 ميكرومتر للتصوير ثلاثي الأبعاد. قم بتسمية الملف مع عينة التفاصيل ومسح التفاصيل وحفظ البيانات.

باستخدام مجهر عمودي متعدد الفوتون مزود بهدف 20x ، احصل على مداخن Z من الجانب العظمي بحجم خطوة من 10 إلى 15 ميكرومتر يصل إلى عمق 700 ميكرومتر. بعد تخدير الفأر ونقعه باستخدام PBS و paraformaldehyde ، قم بتشريح جزء الجسم فوق مستوى الحجاب الحاجز. ثبت الجزء السفلي من الجسم بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة يوم إلى يومين عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، اغسل العينة جيدا في PBS لمدة 10 دقائق ، وكرر ذلك ثلاث مرات. احتضان العينة في محلول مكعب 20٪ لمدة 48 ساعة. بعد الغسيل باستخدام PBS ، احتضان العينة في محلول PGST طوال الليل للنفاذية والانسداد.

في اليوم التالي، احتضان العينة بالأجسام المضادة الأولية في محلول PGST عند أربع درجات مئوية مع رج لطيف لمدة 10 إلى 12 يوما. بعد غسل العينة في PGST ، أضف الأجسام المضادة الثانوية في DAPI في PGST عند أربع درجات مئوية لمدة سبعة أيام. اغسل العينة جيدا في PGST لمدة ساعة واحدة ، مع تكرار ذلك خمس مرات.

نقل العينة الملطخة إلى سلسلة من التركيزات المتزايدة من محاليل عمل رباعي هيدروفوران للجفاف ، مع احتضان 12 ساعة لكل تركيز. بعد الجفاف ، ضع العينة في محلول ثنائي كلورو ميثان مطلق لمدة ثلاث ساعات لإزالة الدهون. بعد ذلك ، احتضان العينة في معامل انكسار مطابق لمحلول بنزوات بنزوات كحول البنزيل لمدة ثلاث إلى ست ساعات.

للبدء، قم بتحميل الصور المبلطة على شكل Z لصور الشريان الأورطي والجزء السفلي من الجسم إلى محطة عمل معالجة الصور. لترميز عمق حجم خلية أو بنية، استخدم برنامج استعادة الصور لفك الالتواء للصورة الأولية. في برنامج فيجي ، قم بإنشاء إسقاط أقصى كثافة للبيانات غير المعقدة باستخدام ترميز الألوان الزمني.

قم بتحميل سلسلة صور TIFF المبلطة بالمكدس Z في البرنامج. باستخدام المكون الإضافي لخياطة فيجي ، قم بتجميع الصور وحفظها بتنسيق TIFF. بعد ذلك ، قم بتحميل الصور المخيطة في برنامج تصور ثلاثي الأبعاد لتجزئة الصور.

تتبع الهياكل العصبية يدويا في محور XYZ على طول المسار بأكمله بين الشريان الأورطي والعقد. قم بتحميل الصور المعالجة مسبقا في برنامج تحليل الصور. استخدم التألق الذاتي لتقسيم الشريان الأورطي والأنسجة الضامة.

ضع ألوانا زائفة منفصلة لتصور جدار الأبهر المميز واللويحات. أخيرا ، استخدم وظيفة معادلة الرسم البياني التكيفي المحدود للتباين لتحسين التباين المحلي على خلفية الصور المعالجة. كشف الشريان الأورطي تصلب الشرايين الذي تم تطهيره TDE عن الخلايا التائية الملطخة ب CD3e في لويحات ، وهي تكوين جديد واسع النطاق للألياف العصبية الملطخة ب NF200 في الأعضاء اللمفاوية الشريانية الثلاثية.

أظهر التصوير متعدد الفوتونات للشريان الأورطي البطني المصاب في الفئران بالضربة القاضية APOE أن ينبت محور عصبي يعبر عن NF200 في المناطق التي تفتقر إلى الخلايا البائية الإيجابية B220 داخل الأعضاء اللمفاوية الشريانية الثلاثية. تصور تصوير الألواح الضوئية لبطن الفأر الذي تم تطهيره بواسطة iDISCO العلاقة المكانية بين الشريان الأورطي والعقد الودي مع المحاور الملونة بتقنية NF200 المشكلة حديثا على الهجوم المجاور للوحة تصلب الشرايين.