يسهل Glycoproteomics الموجه ب Glycomics التنميط الشامل للجليكوبروتيوم في البيئات الدقيقة المعقدة للورم

لذلك ندرس الكربوهيدرات المعقدة ، أو الجليكان ، في الجهاز المناعي الفطري والاضطرابات المرتبطة بالمناعة ، مع التركيز حاليا على الإنتان والسرطان. يتضمن عملنا طرقا تحليلية وأنظمة بيولوجيا السكر ، بما في ذلك طرق علم السكر السكري وعلم السكر ، للتوصيف التفصيلي للبروتين السكري البشري. شهدت Glycoproteomics تقدما هائلا على مدى العقود الماضية ، ولم يعد التقدم مقيدا بنقص بيانات قياس الطيف الكتلي عالية الجودة المتاحة.

بدلا من ذلك ، يكمن التحدي في تفسير وتوليد المعرفة البيولوجية من البيانات الطيفية. تمكن طريقة glycoproteomics الموجهة بعلم الجليكو علماء الجليكو من الحصول على رؤية عميقة ودقيقة للجليكوبروتيوم والحواجز الصلبة مع مؤشرات صحة الإنسان ، Glycoproteomics قادر بشكل فريد على توليد رؤى خاصة بالموقع في glycoproteome. لكن معدلات الببتيد الجليكوبتيد لا تزال مرتفعة.

لمعالجة مشكلات التكاثر هذه ، تتيح طريقة glycoproteomics الخاصة بنا التنميط الدقيق للجليكوبروتيوم من خلال تحديد القيود في مساحة البحث عن الجليكان من خلال مسح الجليكومات لنفس العينة. في النهاية ، يتيح عمليات بحث أسرع وأكثر دقة عن الجليكوببتيد. تسمح طريقة الجليكوبروتيوميك الموجهة بالجليكوميد الخاصة بنا برسم خرائط شامل لعدم تجانس وديناميكيات مؤشرات الجليكوبروتيوم من مجموعة متنوعة من العينات البشرية المختلفة.

لذلك يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في فهم تطور المرض بشكل أفضل ويمكن أن تساعدنا أيضا في العثور على مؤشرات حيوية تشخيصية جديدة للأهداف العلاجية ضد مجموعة متنوعة من الأمراض البشرية. تسمح لنا طريقة glycoproteomics الموجهة بعلم السكر بفك تشفير تعقيد الجليكوبروتيوم البشري ، والتي بدورها تفتح أسئلة بيولوجية جديدة مثل كيفية تأثير هياكل الجليكان على وظيفة البروتين أو التواصل الخلوي أو الاستجابات المناعية. كما أنه يثير تساؤلات حول كيف ولماذا تغير نمط الارتباط بالجليكوزيل في بعض الأمراض.

وقد تؤدي هذه الأفكار إلى اكتشافات وعلامات تشخيصية جديدة وعلاجات مخصصة في الأمراض المعقدة. لتثبيت البروتين محل الاهتمام على غشاء PVDF ، باستخدام ثقب ثقب واحد ، قم بقطع الغشاء بناء على عدد العينات المراد رصدها. بلل الأغشية المقطوعة بالميثانول ، ثم انقلها إلى صفيحة مسطحة القاع سعة 96 بئرا.

بمجرد أن تقترب الأغشية من الجفاف ، ضع 2.5 ميكرولتر من عينات البروتين لكل بقعة. جفف الأغشية بالهواء عند 20 إلى 25 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات على الأقل ، أو يفضل بين عشية وضحاها ، مع الحرص على تجنب التلوث. أضف 100 ميكرولتر من 1٪ PDP-40 في الميثانول إلى كل بئر يحتوي على الأغشية المرقطة.

رج الطبق في محلول PDP-40 عند 20 إلى 25 درجة مئوية. بعد خمس دقائق ، تخلص من محلول PDP-40. بعد ذلك ، اغسل كل بئر يحتوي على بقع البروتين المسدودة ب 100 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ورج الطبق لمدة خمس دقائق.

أضف 15 ميكرولترا من محلول PNGase F إلى كل بئر. لمنع الجفاف ، أضف الماء إلى الآبار الفارغة المحيطة. أغلق اللوحة بعناية بغشاء شفاف واحتضنه لمدة ثماني ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، قم بصوتنة اللوحة لمدة خمس دقائق لمساعدة أي قطرات متبخرة على جوانب الآبار على التجمع في الأسفل. نقل عينات N-glycan التي تم إطلاقها إلى أنابيب فردية من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر. اغسل كل عينة جيدا مرتين ب 20 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، مع شفط ودمج جميع العينات المتبقية في الأنابيب الجديدة.

بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من أسيتات الأمونيوم 100 مللي مولار درجة الحموضة 5 واحتضن العينات لمدة ساعة واحدة عند 20 إلى 25 درجة مئوية. جفف عينات N-glycan في نظام مكثف فراغي. لتحضير كربون الجرافيت المسامي محلي الصنع، أو استخراج الطور الصلب PGC-C18، أو أعمدة SPE الدقيقة، استخدم حقنة لتوصيل أقراص C18 ونقلها إلى أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر.

ماصة عبارة عن 10 ميكرولتر من ملاط راتنج PGC معلق في 50٪ من الميثانول في الأعمدة الدقيقة C18 SPE. ضع الأعمدة الدقيقة في أنابيب سعة 2 مليلتر مع محولات أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. قم بتدوير الأنابيب لإنشاء أعمدة صغيرة PGC-C18 SPE بارتفاع عمود تقريبي يبلغ 0.5 سم.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 0.1٪ ، أو TFA ، في الأسيتونيتريل في الأعمدة الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 جم لمدة 60 ثانية لتسهيل مرور المراحل المتنقلة عبر الأعمدة الدقيقة. وبالمثل ، اغسل الأعمدة الدقيقة ورطبتها ثلاث مرات باستخدام TFA مائي 0.1٪. ضع عينات N-glycan على كل عمود دقيق بأحجام تحميل تصل إلى 40 ميكرولترا.

قم بتدوير العمود الصغير بعد كل إصدار ، وكرر حتى يتم تحميل العينة بأكملها. اغسل كل عمود صغير ب 20 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. انقل الأعمدة الدقيقة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 ملليلتر.

لتصفية N-glycans ، أضف 40 ميكرولترا من 0.1٪ TFA في 50٪ أسيتونيتريل إلى كل عمود صغير. قم بتدوير الأنابيب واجمع التميص من كل دورة. جفف N-glycans المحلى في نظام مكثفات مفرغة.

تصفح البيانات الأولية LC-MS / MS التي تم إنشاؤها باستخدام البرامج المناسبة. تأكد من جودة البيانات العالية من خلال تقييم عرض ذروة LC الضيق ، والفصل الفعال لأيزومرات N-glycan ، ودقة MS العالية ، والدقة ، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء ، إلى جانب كفاءة تجزئة CID MS / MS . حدد يدويا N-glycans في العينة بناء على كتلة السلائف أحادية النظير ، وأنماط تجزئة CID MS / MS ، وأوقات الاحتفاظ النسبية والمطلقة PGC-LC.

من أجل التقدير الكمي النسبي N-glycan ، قم بإنشاء قائمة انتقالية تحتوي على نسبة كتلة السلائف أحادية النظير إلى الشحنة لجميع أيزومرات N-glycan المحددة. حدد قيم المنطقة الواقعة أسفل المنحنى من الكروماتوغرامات الأيونية المستخرجة لجميع أيونات سلائف N-glycan. لتحضير الأعمدة الدقيقة ZIC-HILIC-C8-SPE باستخدام حقنة، قم بتوصيل أقراص C8 ونقلها إلى أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر.

قم بإيداع ملاط من راتنج ZIC-HILIC المعلق في الميثانول في الأعمدة الدقيقة C8-SPE. ضع الأعمدة الدقيقة في أنابيب سعة 2 مليلتر مع محولات أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، مما يضمن تعليق الأعمدة في المركز. قم بالدوران لإنشاء أعمدة صغيرة C8-SPE HPLC بارتفاع تقريبي يبلغ سنتيمترا واحدا.

أضف 50 ميكرولترا من الميثانول إلى الأعمدة الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 جم لمدة 60 ثانية ، مما يسمح للمراحل المتنقلة بالمرور عبر العمود. وبالمثل ، اغسل الأعمدة الدقيقة ثلاث مرات ، كل منها ب 50 ميكرولترا من الماء فائق النقاء متبوعا ب 50 ميكرولترا من 1٪ TFA في 80٪ أسيتونيتريل. أعد تعليق مخاليط الببتيد المجففة المخصصة لإثراء N-glycopeptide في 50 ميكرولتر من 1٪ TFA في 80٪ أسيتونيتريل ، واخلطها جيدا.

ضع الأعمدة الدقيقة ZIC-HILIC-C8-SPE في أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر مع محولات أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. ضع مخاليط الببتيد المعلقة على كل عمود دقيق وقم بالدوران عند 2000 جم لمدة 60 ثانية. اجمع التدفق عبر الكسور وأعد تطبيق كل كسر على نفس العمود الصغير ZIC-HILIC-C8-SPE.

ثم قم بإزالة N-glycopeptide بإضافة متسلسلة ل 50 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 25 ملليمولار و 50 ميكرولتر من 50٪ أسيتونيتريل. انقل الأعمدة الدقيقة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة منخفضة الربط سعة 1.5 ملليلتر. لتصفية N-glycopeptide المحتفظ به بالتتابع ، أضف 50 ميكرولترا من TFA المائي بنسبة 0.1٪ في الأعمدة الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 جم لمدة 60 ثانية.

ثم قم بإزالة N-glycopeptide بإضافة متسلسلة ل 50 ميكرولتر من 0.1٪ TFA مائي متبوعا ب 50 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 25 ملليمولار و 50 ميكرولتر من 50٪ أسيتونيتريل. اجمع وجمع وتجفيف N-glycopeptides المخصب والببتيد غير المعدل يتدفق عبر الكسور في نظام مكثف الفراغ. حدد تحليل بيانات N-glycomics 76 أيزومرات N-glycan في أنسجة سرطان القولون والمستقيم مع 70٪ جليكان معقد / هجين ، و 20٪ قليل الجليكومانوز ، و 10٪ بوسيمانوز.

تم تأكيد جميع هياكل N-glycan بأدلة طيفية ، تم تحديدها كميا باستخدام قيم المساحة تحت المنحنى من كروماتوغرامات الأيونات المستخرجة.