تصوير الكالسيوم أحادي الخلية لدراسة تنشيط قنوات أيونات الكالسيوم

درسنا قنواتنا المتعلقة بالإحساس بدرجة الحرارة والإحساس بالعمر والإحساس بالألم. نحن مهتمون بفحص أنشطة الجزيئات الصغيرة في قنواتنا ودراسة آلياتها. لقد قمنا بفحص اثنين من ناهضات تنشيط TRPV1 وأجرينا دراسة مفصلة حول آليات عملهما.

تتيح هذه التقنية المراقبة في الوقت الفعلي والكمي والمتزامن لتغيرات الكالسيوم في خلايا متعددة ، مما يجعلها نهجا بسيطا وسريعا لتطبيقات البحث. نهدف إلى استكشاف آلية علاج الأدوية الصينية التقليدية لمختلف الأمراض من خلال تحديث القنوات الأيونية المتعلقة بالكالسيوم. للبدء ، قم بإعداد شرائح زجاجية معقمة بقطر ثمانية ملليمترات وضعها في طبق 24 بئر.

أضف 500 ميكرولتر من محلول Poly-D-lycine إلى كل بئر. احتضن الشرائح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح بالطلاء. ثم باستخدام ماصة ، تخلص من محلول الطلاء من كل بئر.

اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني من Dulbecco واترك الشرائح المغسولة جانبا لاستخدامها لاحقا. قم بزرع الخلايا على صفيحة 24 بئرا المحضرة بكثافة حوالي 1.5 في 10 إلى قوة 5 خلايا لكل بئر ، وضع اللوحة في الحاضنة حتى تلتصق الخلايا. بعد ذلك ، امزج محلول مخزون Fura-2 / AM و Pluronic F-127 مع مخزن هانك الذي يحتوي على 1.3 مللي مولار من أيونات الكالسيوم.

باستخدام رقائق الألومنيوم ، قم بتغطية محلول العمل Fura-2 / AM لحمايته من الضوء. للمعالجة المسبقة للخلايا ، انقل الشرائح الزجاجية مع الخلايا إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا تحتوي على عازلة هانك. باستخدام ماصة ، تخلص من المخزن المؤقت من كل بئر وأضف 500 ميكرولتر من عازلة العمل Fura-2 / AM إلى كل بئر.

احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة للسماح بتحميل المسبار. ثم قم بإزالة المخزن المؤقت للعمل Fura-2 / AM من كل بئر واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت هانك لإزالة Fura-2 / AM الزائد. للبدء ، احصل على الخلايا المعالجة مسبقا لتصوير الكالسيوم أحادي الخلية وابدأ جميع مكونات المجهر الفلوري.

افتح برنامج التصوير الفلوري من الخيارات المتاحة. حدد البروتوكول المطلوب وانقر فوق موافق. ثم اختر تجربة جديدة من القائمة الرئيسية لبدء إعداد تجريبي جديد.

الآن ، قم بتركيب غرفة التروية على مرحلة المجهر وضع شرائح الخلية المعالجة Fura-2 / AM بعناية في الغرفة التي تحتوي على محلول هانك العازل. اضبط التركيز تحت الضوء الأبيض للحصول على عرض مثالي. حدد التركيز على لوحة تحكم التجربة.

اختر الطول الموجي المطلوب للتركيز البؤري مثل 380 نانومتر وانقر فوق بدء التركيز لبدء التعديلات البؤرية. اضبط التركيز على الخلايا باستخدام التركيز التقريبي لتقريب الهدف، متبوعا بالبحث عن التركيز لإجراء تعديلات دقيقة. لاحظ التعبير عن البروتين المستهدف من خلال الأطوال الموجية ل FITC أو TRITC.

ثم انقر فوق إيقاف التركيز البؤري وأغلق لوحة التركيز. انقر فوق تكوين التجربة في شريط المهام وحدد الطوابق المطلوبة للتصوير في إعدادات التكوين. انقر الآن على المنطقة زر في شريط القائمة لتحديد مناطق التصوير واختر نوع الإضاءة المطلوبة للتصوير.

انقر فوق الحصول على الصور ، ثم اضغط على موافق لالتقاط الصور. حدد الخلايا المرغوبة التي تعبر عن البروتين المستهدف تحت التألق ، مع مراعاة القراءة الفارغة مع عناصر التحكم التي تقل عن 380 نانومتر. للتراجع عن منطقة محددة، انقر بزر الماوس الأيمن على الدائرة وحدد حذف المنطقة.

افتح قائمة المراجع ، وحدد المربع طرح المراجع ثم انقر فوق موافق لتطبيق طرح الخلفية. في لوحة تحكم التجربة، انقر فوق بيانات السجل لتسجيل بيانات التجربة. في قسم الفاصل الزمني في لوحة التحكم، قم بتعيين الفاصل الزمني للحصول على البيانات إلى ثانية واحدة.

ثم انقر فوق Zero Clock and Acquire في لوحة تحكم Experiment لبدء الحصول على البيانات. الآن قم بتطبيق العلاجات على الخلايا وفقا للمتطلبات. بمجرد اكتمال الحصول على البيانات ، انقر فوق إيقاف مؤقت لإيقاف العملية.

احفظ البيانات المكتسبة وتابع التحليل. لإنهاء التجربة ، انقر فوق ملف وحدد إغلاق التجربة. أخيرا ، أغلق البرنامج وانقل جميع البيانات المحفوظة من الكمبيوتر.

أظهرت الخلايا الكيراتينية الأولية المحملة بمسبار Fura-2 مورفولوجيا الخلايا المرئية بطول موجي 380 نانومتر. أظهرت الاستجابة الحرارية للخلايا الكيراتينية زيادة في تركيز أيونات الكالسيوم داخل الخلايا أثناء التسخين مع استجابة مماثلة لوحظت أثناء التبريد. تم إلغاء الاستجابة الحرارية في الخلايا الكيراتينية ، حيث تفتقر إلى جين STIM1 الذي يشير إلى دور الجين في إشارات الكالسيوم الحرارية.

أظهرت الخلايا HEK293T التي تعبر عن STIM1 / Orai1 استجابة حرارية ملحوظة عند التبريد مما يؤكد التعبير الجيني الناجح كما يتضح من علامات التألق الأخضر والأحمر. تم تحفيز استجابة دخول الكالسيوم التي تعمل بالمتجر في الخلايا عبر التعبير عن STIM1-Orai1 بشكل فعال عن طريق التغيرات المتسلسلة في تركيز الكالسيوم خارج الخلية وإصدار حمض السيكلوبيازونيك عن طريق الوفرة. أدى الماصة المباشرة للكابسيسين ، وهو ناهض TRPV1 ، إلى تدفق الكالسيوم خارج الخلية في الخلايا التي تعبر عن بلازميد TRPV1.