تحليل القياس الخلوي الكتلي للاستجابات المناعية الجهازية والمحلية في سرطان الخلايا الكبدية

يسمح لنا قياس الكتلة الخلوي بتحليل الاستجابات المناعية المنهجية والمحلية في سرطان الخلايا الكبدية. من خلال تحديد ملامح الخلايا المناعية على مستوى الخلية المفردة ، نحدد مجموعات فرعية فريدة والحالات الوظيفية المرتبطة بتطور الورم ، مما يقدم رؤى حول آليات التهرب المناعي والأهداف العلاجية المحتملة للعلاجات الشخصية. يستخدم بروتوكولنا قياس الكتلة الخلوي لتحليل أكثر من 14 علامة في وقت واحد على مستوى الخلية الواحدة ، وتجنب التداخل الطيفي المرئي في قياس التدفق الخلوي التقليدي. يتضمن ذلك التحديد الدقيق لمجموعات الخلايا الحقيقية ، ويوفر بيانات عالية الأبعاد للتنميط المناعي التفصيلي واكتشاف المؤشرات الحيوية.

[الراوي] للبدء ، قم بإذابة الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي المجمدة ومعلقات خلايا سرطان الكبد. بعد استعادة الخلايا ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. أضف السيسبلاتين إلى التركيز النهائي البالغ 0.5 ميكرومولار ، واخلطه جيدا ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. لإيقاف التفاعل ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية ، ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول تلطيخ الخلايا إلى كل أنبوب. بعد الطرد المركزي مرة أخرى ، تخلص بعناية من المادة الطافية لإجراء حجب مستقبلات FC ، أولا ، قم بإعداد مزيج كتلة 50 ميكرولتر لكل عينة ، واجمع بين 48 ميكرولترا من مخزن تلطيخ الخلايا مع ميكرولترين من محلول حجب FC. أعد تعليق حبيبات الخلية في مزيج الكتلة واحتضانها. بعد ذلك ، أضف 1.1 ميكرولتر من كل جسم مضاد لكل عينة في أنبوب مسمى لتحضير مزيج الأجسام المضادة للبروتين الغشائي اصنع الحجم إلى 55 ميكرولتر مع مخزن مؤقت لتلوين الخلايا. انقل 50 ميكرولترا من مزيج الأجسام المضادة المحضرة إلى كل أنبوب عينة ، ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر. ثم قم بتدوير العينات برفق لخلطها قبل احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت لتلوين الخلايا إلى كل أنبوب عينة. جهاز طرد مركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية. بعد الغسيل النهائي ، قم بتدوير السائل المتبقي لفترة وجيزة مع حبيبات الخلية لإعادة تعليق الخلايا تماما. لتلوين بروتين النواة ، أضف 500 ميكرولتر من محلول التثبيت المختلط إلى الخلايا المعلقة. اخلطي العينات برفق قبل احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بجهاز الطرد المركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، قم بتعبئة 1000 ميكرولتر من مخزن النفاذية إلى كل أنبوب لغسل الخلايا. ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 1000 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 50 ميكرولترا من خليط الجسم المضاد إلى كل أنبوب بعد التخلص من المادة الطافية. قم بتقطيع الخلايا برفق لخلطها جيدا قبل الحضانة. بعد ذلك ، قم بتحويل 1000 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية إلى كل أنبوب ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى ، ثم تخلص من المادة الطافية. لإصلاح الخلايا ، أضف ملليلتر واحدا من الفورمالديهايد بنسبة 1.6٪ المحضر في PBS في كل أنبوب عينة ودوامة لخلط المحتويات جيدا. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، قم بالطرد المركزي للعينات وتخلص من المادة الطافية. من أجل تلطيخ الإقحام النووي ، قم أولا بتخفيف Cell-ID Intercalator Iridium مع المخزن المؤقت للإصلاح والنفاذية. ماصة مليلتر واحد من محلول الإقحام في كل عينة. امزج بلطف ودوامة. ضع العينات على أربع درجات مئوية طوال الليل ، ثم جهاز الطرد المركزي كما كان من قبل. عند اكتمال الحضانة ، ضع ماصة 1000 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلوين الخلايا في الأنبوب. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 800 جم لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية. أخيرا ، أعد تعليق الخلايا في 450 إلى 900 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. قم بتلطيخ الخلايا باللون الأزرق التربان لعد الخلايا قبل إجراء مزيد من التحليل. للبدء ، قم بتشغيل مقياس الكتلة الخلوي وقم بتشغيل البرنامج. تحليل العينات في نظام CyTOF والحصول على بيانات القياس الخلوي للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي وعينات خلايا سرطان الكبد. قم بتشغيل برنامج معالجة البيانات على الجهاز وقم بالمعالجة المسبقة لمجموعة خلايا CD45 + في ملف FCS. بعد ذلك ، تخلص من الخلايا الميتة باستخدام تلطيخ القابلية للحياة ، مثل استبعاد السيسبلاتين. قم ببوابة مجموعة CD45 + للتركيز على الخلايا المناعية ، وتصدير السكان المسورين لمزيد من التحليل. قم بتحويل البيانات بعامل مساعد من خمسة. بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج التجميع وتحديد المجموعات الرئيسية بناء على خوارزمية SPADE ، وتجميع الخلايا ذات ملفات تعريف تعبير العلامات المتشابهة في مجموعات. قم بتطبيق تضمين الجار العشوائي الهرمي ، أو HSNE ، لتقليل الأبعاد وتحديد المجموعات المميزة. ثم استخدم حزمة مجموعة CyTOF في برنامجنا لإجراء إعادة تجميع المجموعات الرئيسية. استخدم برنامج PhenoGraph لتحديد المجموعات الفرعية ذات المعلمات الافتراضية. تم تحديد ما مجموعه 14 نوعا متميزا من الخلايا في عينات الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي. تم تفصيل أنماط تعبير العلامة لكل نوع من أنواع الخلايا ال 14 في الخريطة الحرارية ، مما يدل على ملفات تعريف تعبير فريدة لمجموعات الخلايا المتميزة. تباين توزيع هذه الأنواع من الخلايا عبر العينات مع العينة D التي تحتوي على نسبة أعلى من الخلايا التائية CD4 ، والعينات A و B التي تظهر تخصيبا كبيرا للخلايا البائية ، و CD141 + ، الخلايا المتغصنة التقليدية ، الموجودة في الغالب في العينة C. تم تحديد ثمانية أنواع من الخلايا في عينات الأنسجة بما في ذلك الخلايا الوحيدة والخلايا التائية والعدلات والخلايا القاتلة الطبيعية ، الخلايا البائية والخلايا المتغصنة البلازمية والحمضات والخلايا المتغصنة النخاعي. تشير ملفات تعريف تعبير العلامة لأنواع خلايا الأنسجة إلى أنماط مميزة لكل مجموعة من الخلايا. أظهرت عينات الأنسجة نسبة ثابتة من أنواع الخلايا عبر جميع المرضى ، مما يعكس الخصائص المناعية المشتركة مع سرطان الخلايا الكبدية.