عزل الكائنات الحية الدقيقة في التربة باستخدام تقنية iChip

نحن نحاول اكتشاف أنواع جديدة من الكيمياء لمكافحة مسببات الأمراض الزراعية. باستخدام تقنية iChip ، قمنا بعزل كائنات جديدة ، والتي نأمل أن تؤدي إلى كيمياء جديدة. ومن المحتمل أن يؤدي اختبار هذه الكائنات الحية و/أو منتجاتها الطبيعية ضد مسببات الأمراض الزراعية إلى العثور على كائنات و/أو مركبات جديدة مرشحة للمبيدات الحيوية.

تسمح لنا طريقة iChip بعزل الكائنات الحية الدقيقة غير القابلة للزراعة في ظل الظروف التقليدية من خلال توفير فترة من التدجين والاتصال ببيئتها الطبيعية. يتميز تصميم iChip المعدل الخاص بنا بأنه بسيط وغير مكلف ويقلل من مخاطر التلوث الميكروبي ، مما يسهل الوصول إليه لمجموعة متنوعة من الأهداف البحثية. تفتح نتائج iChip الخاصة بنا أسئلة مثل ما هي الآليات التي تدفع قمع مسببات الأمراض بواسطة الميكروبات الجديدة؟

يمكن أن تؤدي هذه المركبات النشطة بيولوجيا بشكل موثوق في تجارب العالم الحقيقي؟ كيف تؤثر العوامل البيئية على فعاليتها؟ ستوجه معالجة هذه الأسئلة التطوير المستدام للمبيدات الحيوية ، وتحويل إدارة أمراض النبات ، وتقليل الاعتماد على مبيدات الفطريات الاصطناعية.

سيطبق المختبر تقنية iChip لعزل البكتيريا الجديدة من التربة المثبطة للأمراض التي يتم إنتاجها من خلال زراعة الغطاء ، وتحديد الميكروبات الجديدة والمركبات النشطة بيولوجيا. سيتم اختبارها في دراسات الأمراض النباتية الخاضعة للرقابة لتطوير بدائل مبتكرة ومستدامة لمبيدات الفطريات الاصطناعية لإدارة الأمراض الزراعية. لإنشاء iChip معدلة باستخدام أداة ثقب أجار 5 ملم ، قم بإزالة قيعان الآبار من صفيحة 96 بئرا.

قم بقطع أغشية البولي كربونات 0.05 ميكرومتر إلى مستطيلات ، مما يضمن تطابق الأبعاد مع المساحة السفلية للوحة ذات 96 بئرا. ضع مادة مانعة للتسرب من السيليكون للصق غشاء البولي كربونات في قاع اللوحة المكونة من 96 بئرا. تأكد من أن المادة اللاصقة تغلق الآبار ولكنها لا تغطي فتحات الآبار بالكامل.

اترك الأطباق تجف لمدة 24 ساعة. أضف 4.5 مل من الماء المعقم إلى كل من أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر المسماة من A إلى D ، وإلى كل من أنابيب 50 مليلتر المسماة E إلى H. ثم أضف 10 مل من الماء إلى الأنبوب وقم بدوامة الخليط لمدة 10 دقائق.

اترك تعليق التربة يستقر لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتقطيع 0.5 مل من المادة الطافية للتربة في الأنبوب A وتخلط جيدا. الآن ، انقل 0.5 مل من تعليق الخلية من الأنبوب A إلى الأنبوب B واخلطه جيدا.

كرر ذلك مع جميع أنابيب الطرد المركزي المتبقية ، مع إكمال سلسلة من التخفيفات عشرة أضعاف عبر الأنابيب الثمانية. للبدء ، اغمر iChips بالكامل في 95٪ من الإيثانول. بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة الألواح من الإيثانول وضعها على منشفة ورقية معقمة في غطاء التدفق الرقائقي.

اترك الإيثانول يتبخر أثناء تشغيل معقم الأشعة فوق البنفسجية في غطاء التدفق الرقائقي لمدة 15 دقيقة. ماصة 360 ميكرولتر من الأملاح السكسينات المعقمة أو وسائط الرسائل القصيرة في العمود الأول من اللوحة لتكون بمثابة عنصر تحكم. أضف 45 مل من الرسائل القصيرة إلى تعليق الخلية في الأنبوب E.Mix جيدا لدمج تعليق الخلية مع أجار.

ماصة 360 ميكرولتر من خليط خلية الأجار في جميع الآبار المتبقية من اللوحة المكونة من 96 بئرا. بمجرد ضبط الوسائط ، أغلق الجزء العلوي من اللوحة بغطاء لوحة PCR. املأ الألواح باستخدام الأنابيب F و G و H لتحضير ما مجموعه أربع ألواح باختلاف عشرة أضعاف في التركيزات.

ضع الألواح في وعاء يحتوي على حوالي 1 بوصة من التربة بحيث يكون جانب الغشاء متجها لأسفل. احتضن الألواح داخل الحاوية المغطاة في الظلام عند 25 درجة مئوية. بعد ستة أسابيع ، افحص iChips بحثا عن نمو الميكروبات.

اشطف iChip المعدلة ثلاث مرات بالماء المعقم لإزالة جميع جزيئات التربة. امسح الجزء العلوي والجوانب من اللوحة بنسبة 95٪ من الإيثانول ، وتجنب الجانب الذي يحتوي على الغشاء شبه النفاذ. باستخدام شفرة معقمة ، قم بقطع غطاء اللوحة حول بئر يحتوي على مستعمرة ، وقم بإزالة المربع بملاقط معقمة.

باستخدام أداة خطوط معقمة ، اخترق المستعمرة وخطها على لوحة أجار SMS بطريقة الأرباع. احتضان الصفائح عند 25 درجة مئوية لمدة أسبوع أو حتى يلاحظ نمو المستعمرة. بعد الحضانة ، افحص المستعمرات لتأكيد عزل الثقافات.